病理染色技术 | 一分钟讲透免疫荧光染色，看这篇足够了

生物科研实验室

免疫荧光染色原理
免疫荧光（immunofluorescence, IF）技术通过标记抗体以荧光基团，生成荧光抗体作为检测工具，用以识别细胞或组织内的特定抗原（即靶蛋白）。借助荧光显微镜，可观测到荧光信号在细胞或组织中的分布，进而明确抗原的性质及其定位。优势在于能精确确定蛋白表达位置，并辅助评估蛋白表达量。
具体操作步骤
IF染色流程精炼为八大环节：脱蜡至水；过氧化氢实现通透；抗原修复；羊血清进行封闭；一抗孵育；复温；二抗孵育；封片。以下是对各步骤的具体操作步骤：01 脱蜡至水步骤：切片于55℃烘箱中预热30分钟，后依次浸入二甲苯（三次，每次5分钟）、无水乙醇（三次，每次5分钟）、95%乙醇（一次，5分钟）、70%乙醇（一次，5分钟），最后以双蒸水冲洗5分钟。目的：去除石蜡，调整样本水分，为后续染色铺垫。
02 过氧化氢通透步骤：切片浸泡于3% H2O2中15分钟，后于PBS中清洗三次，每次5分钟（摇床）。目的：消除内源性过氧化物酶活性。
03 抗原修复步骤：切片置于柠檬酸盐修复液(pH6.0)中，高压锅加热至水沸后持续5分钟，自然冷却至室温，随后于PBS中清洗三次，每次5分钟（摇床）。原理与目的：因甲醛固定可能导至抗原决定簇遮蔽，此步骤旨在恢复抗原的自然构象。
04 羊血清封闭步骤：以10%羊血清室温封闭至少40分钟（摇床）。目的：阻断非特异性抗原结合位点。
05 一抗孵育步骤：移除封闭液，每组织点加30 μL稀释一抗，湿盒内4℃过夜。
06 复温步骤：重复过氧化氢通透处理的步骤。目的：进一步确保内源性过氧化物酶的清除。
07 二抗孵育步骤：滴加20 μL稀释荧光二抗，37℃孵育1小时，之后PBS清洗三次，每次5分钟（摇床）。
08 封片与观察步骤：使用含DAPI的抗荧光淬灭封片液封片，随后通过荧光显微镜进行图像采集。

染色效果：DAPI将细胞核染成蓝色，而目标蛋白的阳性表达则以对应荧光素标记的红色或绿色呈现。
数据分析：通过IF染色能够精确定位蛋白表达位置，辅助估算蛋白表达量。具体操作中，可利用Image J软件对阳性细胞比例或阳性区域比例进行测量，并借助GraphPad Prism进行图表绘制与分析。