养死了多少细胞，才总结出来这11条干货！（SCI高分大佬推荐）

非诚勿扰孟非

细胞培养的路上，有多虐心就有多少需要值得注意的地方。小小的平皿之中，细胞点点，引无数英雄竞挂东南枝。
正所谓“万事开头难”，即便是细胞复苏与保存这两件看似简单的事情，也能造成实验汪内心无比巨大的阴影面积。
好在我这里有本细胞培养秘籍，可让细胞这个熊孩子彻底变为你的贴心小棉袄。


细胞复苏步骤：


细胞冻存步骤：


其实，刚刚复苏的细胞就像是刚刚出生的baby，非常脆弱，需要各位小伙伴的细心呵护，不然，细胞就会被我们花样养死。为了避免细胞不明不白的挂掉，我们就要对细胞的各种习性了如指掌。
1. 俗语道，到什么山上唱什么歌，不同细胞用不同的培养液。此时，就不得不提起培养基里的“四大金刚”—MEM、DMEM、1640、F-12，它们基本参与了90%以上种类细胞的培养过程。
MEM作为带头大哥，能力非常全面，号称是应用最广泛的细胞培养液。
DMEM作为随时紧跟老大MEM的二弟，青出于蓝而胜于蓝，浓度要高出2~4倍，可分为高糖型（含葡萄糖4500mg/L）和低糖型（含葡萄糖1000mg/L）。
老三1640中规中矩，营养成分比较简单，比DMEM少一点糖和谷光甘肽，常用于淋巴细胞的培养。
小兄弟F12常用来支持CHO、Hela和L－细胞生长以及原代大鼠肝细胞和前列腺上皮细胞的培养。MEM和F12 这两种培养基各取1/2，即可形成神经生物学最通用的培养基。
在此，奉送一个不同细胞系对应的不同培养液的图，供大家参考。




2. 细胞生长的空间密度是细胞培养的关键。具体养细胞时应该摸索细胞喜欢的生长空间密度，即不能让细胞瓶里的细胞因拥挤不堪而萎靡不振；也不能让细胞浓度低于1~5×105个/mL而导致“孤独死”（因为细胞的健康生长需要细胞间的连接）。因而细胞接种前，要先通过细胞计数来调整细胞浓度。
3. 当培养的贴壁细胞形态不好时，可在传代时，先倒掉旧的培养基，加入3ml新的培养基（有无血清都可以）洗涤一次，用滴管吸走，再加入3ml培养基，沿着瓶底轻轻吹打一遍，然后吸走。这时在正式进行消化、吹打。
其次，把吹打下的细胞悬液加入到含有新培养基的培养瓶内，置于培养箱里培养，按时间点观察细胞贴壁情况（10min,20min,30min）。而后迅速倒出其中的培养基，加入3ml新培养基再轻轻洗一次，然后加入完全培养基培养并观察细胞生长情况以及形态。直至找到细胞完美的形态为止。
4. 至于在培养瓶中加入多少培养基量，则需要实验汪们自己去摸索的。对于生长快的细胞，易生长的细胞加少一点培养基，细胞形态会更好，但是要注意对换液时间的把握。
5. 如何选择培养瓶：一般，生长速度慢的细胞如果想要更漂亮的细胞状态，那么采用塑料瓶会比玻璃瓶的效果好；生长速度快的细胞，用玻璃瓶培养的效果会更好。因此，对于同一种细胞，在其生长速度慢的时候（比如细胞刚复苏时或者原代培养），塑料瓶会好一点；而在其生长旺盛的时候，玻璃瓶则相对会好一点。
6. 细胞冻存时，盖子要拧紧，不然复苏水浴时会渗水，造成细胞污染。因而冻存管要选择原配的管子和盖子（不同牌子、型号的管子会有差别），盖子拧紧后最好用封口膜封住。且每支冻存管都要标上细胞的名称、冻存时间，并记录在册，以免后续复苏细胞时，取错细胞。
7. 细胞冻存时要严格进行梯度降温（-4℃→-20℃~-40℃→-80℃→液氮）。要知道冰火两重天的生活环境只会让娇弱的细胞自爆身亡，谨记：缓降温！但如果真心赶时间时，可用使用细胞冻存盒进行细胞冻存，而后尽快将其转入液氮中。此外，要定期测量液氮罐里的液氮储备，以保证细胞全部浸在液面下。
8. 细胞解冻时，由于冻存管管壁较厚、隔热，而导致水浴时间太长（2min还没融化）时，可以将水浴锅的温度调至40℃左右，可以缩短解冻时间。
9. 提前预定超净台，减少复苏后插在冰盒里等待的时间，可避免细胞房人满为患，超净台使用紧张，复苏1h后，还没有加入新的培养液。（高浓度DMSO防止胞内形成冰晶，冻存时保护细胞，但复苏融解后，浸泡时间太久会，对细胞有毒性）
10. 复苏细胞时一定要有耐心，因为有些细胞在复苏一星期后才会真正有起色。因而，尽管细胞在复苏三四天后没有任何动静，也不要轻易倒掉所有细胞，要耐心等待，两周后再做决定。
11. 有关DMSO的一些注意事项：
DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内的离子浓度、减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤程度。
DMSO在溶解过程中会放热，应先与培养基混匀后再加血清，同时冻存液最好提前配置，DMSO现配对细胞的毒性可能更大；
复苏时，要离心去除DMSO，并用新鲜的培养基洗涤1-2次，注意离心的时候速度不要太快。
细胞培养小技巧今天就讲到这里。你可以先把这篇文章保存下来，当你遇到问题的时候再来看也许会更有感觉。

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作者：萌董董
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