荧光定量PCR的基本原理

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实时荧光定量PCR

1996年，实时荧光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR) 由美国Applied Biosystems公司首先推出，所谓Real-time qPCR是指在PCR反应中加入荧光基团，通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，即时分析目的基因的初始量，该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。


荧光化学物质

目前根据Real-time qPCR所使用荧光化学物质不同，将其分为荧光染料和荧光探针两类。



荧光化学物质发光原理

荧光染料

荧光染料也称DNA结合染料，目前主要使用的染料分子是SYBR Green I，SYBR Green I能与DNA双链的小沟特异性的结合，游离的SYBR Green I几乎没有荧光信号，但结合双链DNA后，其荧光信号可呈数百倍的增加。随PCR产物的增加，PCR产物与染料的结合量也增大，其荧光信号强度代表双链DNA分子的数量。
荧光染料的优点：

• 使用简便；
  
• 可以与任何PCR产物结合；
  
• 价格便宜；
  

荧光染料的缺点：

• 不能区分不同的双链DNA
  
• 引物二聚体会影响检测的敏感性
  
• 非特异性产物会影响结果的敏感性
  

引物二聚体和非特异性扩增问题可以通过熔解曲线 (Melting curve) 进行识别，进而通过PCR引物的设计和反应条件的优化得以解决。
总的来说，SYBR Green I方法是一种最基础也最常用的Real-time qPCR实验手段。
荧光探针

Real-time qPCR中最常用的荧光探针为TaqMan探针，其基本原理是依据目的基因设计合成一个能够与之特异性杂交的探针，该探针的5'端标记荧光基团，3'端标记淬灭基团。
正常情况下两个基团的空间距离很近，荧光基因因淬灭而不能发出荧光。PCR扩增时，引物与该探针同时结合到模板上，探针的结合位置位于上下游引物之间。
当扩增延伸到探针结合的位置时，Taq酶利用5'外切酶活性，将探针5'端连接的荧光分子从探针上切割下来，从而使其发出荧光。检测到的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，因此，根据PCR反应体系中的荧光强度即可计算出初始DNA模板的数量。
TaqMan探针技术解决了荧光染料与非特异性扩增结合的问题，反应结束后无需通过熔解曲线检测，缩短了实验时间。
TaqMan探针技术的优点：

• 荧光背景低；
  
• 敏感性高；
  
• 杂交稳定性高；
  
• 荧光光谱分辨率好；
  
• 特异性高。
  

TaqMan探针技术的缺点：

• 成本高；
  
• 设计难度大；
  
• 只能用于检测产物长度低于150bp的反应。
  

由于TaqMan探针的高特异性，可用于等位基因的辨别，特别适用于人类基因多态性以及根据SNP区别和定量菌株。
<hr/>Real-time qPCR技术的定量原理

扩增曲线

在Real-time qPCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的检测并记录其荧光信号，随着反应的进行，监测到的荧光信号可以绘制成一条曲线，即为扩增曲线。
荧光扩增曲线一般分为基线期、指数增长期和平台期。
在Real-time qPCR扩增早期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化，此时即为基线期。
PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数形式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数形式生成模板，从而进入“平台期”。在该时期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR的终产物量与起始模板量之间无线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出初始模板量。
只有在荧光信号的指数增长期，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。



扩增曲线和Ct值

荧光阈值

为了便于对所检测样本进行比较，首先需设定一个荧光信号的阈值，荧光阈值是在扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置上，一般荧光阈值设置为3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，但实际应用时要结合扩增效率、线性回归系数等参数来综合考虑。
通常荧光阈值都是Real-time qPCR仪器自动设置，如无特殊情况，无需更改。
循环阈值

循环阈值 (Cycle threshold valve, Ct) 即Real-time qPCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经过的扩增循环次数，Ct值与荧光阈值有关。
一般Ct值位于指数增长期的开始阶段，此时样品间细小物差尚未放大且扩增效率也相对恒定，因此该Ct值具有极好的重复性，尽管平台期的DNA拷贝数波动很大，Ct值却是相对固定的。



Ct值的确定原则

<hr/>定量原理
对于一个理想的Real-time qPCR反应：


对于一个非理想的Real-time qPCR反应：


其中，n为扩增反应的循环次数，Xn为第n次循环后的产物量，X0为初始模板量，E%为扩增效率。
在Real-time qPCR中，在扩增产物达到荧光阈值线时：


其中，XCt为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量，在荧光阈值设定以后，XCt为一个常数；
将上述公式两边取对数，并换算可得如下公式：


即Ct值与lgX0呈负相关，据此即可计算出样本中所含的初始模板量。

<hr/>Real-time qPCR的优点

• 特异性好，使用特异性探针对定量分子进行识别，具有很高的准确性。
  同时，靶序列由引物和探针双重控制，假阳性低。
  
• 灵敏度高，Real-time qPCR技术是综合了PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显像技术为一体的技术，因此它的检测灵敏度很高。
  
• 准确性高、检测范围宽，由于荧光信号的产生和每次扩增产物成线性对应的关系，通过荧光信号的检测可以直接对产物进行定量；定量范围可在0-1010拷贝/毫升。
  
• 操作简单、安全、无污染，扩增和检测可以在同一管内进行，不需要开盖，不易污染，同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理，不再需要担心放射性污染。
  
• 速度快、通量高，可在2-3小时内完成96个样品的定量分析。
  

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