质谱检测是什么？

幸福侠侣

华简检测提供质谱检测服务，咨询热线：182-0189-6255（同微信号）；

原文地址：https://www.zhihu.com/question/515171632

清风寡欲

前言
质谱（mass spectrometer）作为一种称量分子”质量”的利器，能够对目标物进行定性和定量分析，具有高通量、高灵敏度、分析速度快等特点，几乎已成为科研及检测机构必备的神器，被广泛地用于各种领域。我们接着上一讲——蛋白质组学中样品制备流程，继续简要介绍质谱检测的一般过程。
样品引入
蛋白质组学领域中，质谱通常与液相色谱联用，达到进样和分离的目的。目前市面上的液相色谱仪型号众多，外观也各不相同，但内在主要构造和进样过程并无本质差别。水相和有机相（统称流动相）混合后通过高压泵注入，样品通过自动进样系统注入，并被流动相带入分析柱进行结合，随着流动相中有机相的比例逐步提升，分析柱中结合的蛋白被逐渐洗脱下来，最终到达质谱的前端——离子源。



（LC的基本结构和过程）

色谱仪中有一个非常关键的小部件——六通阀，可用于控制进样，切换样品和流动相的注入（视频仅供学习参考）。
感兴趣的小伙伴如果理解了它的工作原理，相信对液相的进样过程会有更清晰的认识。
质谱检测
样品经过液相后，就会到达质谱进行检测，目前蛋白质组学中常用的质谱仪器主要有Sciex公司的TripleTOF，Thermo公司的Orbitrap系列，以及Bruker公司推出的目前4D蛋白质组学质谱新锐timsTOF系列。虽然不同型号的质谱外观各不相同，但其内部结构非常相似，都具有离子源（Ion source）、质量分析器（Mass analyzer）、检测器（Detector）三大部分。用于蛋白质组学检测的高分辨仪器中，通常会采用电喷雾离子源，并串联使用两个甚至更多不同的质量分析器。



（Orbitrap Exploris 480的硬件结构）

下面主要以Orbitrap Exploris 480为例，简要介绍一下质谱检测的大致过程：
首先，液相导入的样品会源源不断地经过电喷雾离子源（Electrospray Ion Source），在高电压下雾化成带电液滴。带电液滴中的溶剂迅速被气化，液滴体积逐渐缩小，其电荷密度超过表面张力极限时会引起液滴“库仑爆炸”。随着溶剂进一步蒸发，最终形成带正电荷的气态肽段离子。


气态肽段离子随即进入高容量离子传输管（High Capacity Transfer Tube）和电动离子漏斗（Electrodynamic Ion Funnel），这个过程可捕获和聚焦离子并进行离子传输。


离子通过离子传输管和离子漏斗之后，会进入轴向弯曲设计（能防止中性或不需要的离子进入四极杆，从而提高稳定性降低噪音）的主动离子束传输系统（Advanced Active Beam Guide ）和分段式四极杆（Advanced Quadrupole Technology），四极杆可通过施加直流电压/射频电压，从而实现对离子的选择和传输，也是目前主流质谱仪通常串联使用的第一个质量分析器。     


随后，离子会被转移至弯曲线性阱（C-trap），与氮气发生碰撞而失去动能，从而得到冷却，同时C-trap会通过其轴线上产生的电势阱，将离子挤压进质谱的核心部件——Orbitrap质量分析器（Orbitrap Mass Analyzer）中。
在离子阱质量分析器中，肽段离子或碎片离子会在电场作用下会围绕中心电极的径向和轴向做谐波振荡，由检测器检测各个离子的共振频率和信号强度，根据傅里叶变换公式根据共振频率计算各离子的质荷比，从而绘制形成一级谱图和二级谱图。除了Orbitrap质量分析器，在TripleTOF和TimsTOF系列使用的飞行时间质量分析器（Time-Of-Fly Mass Analyzer）中，不同质荷比的离子具有不同的飞行速度，因此到达检测器的时间不同。检测器会检测不同离子的飞行时间和信号强度，计算离子质荷比后绘制质谱谱图。
至此，质谱基本完成一个扫描循环中的一级全扫描分析（Full Scan Analysis），得到一级质谱图（MS1 spectrum）。
进行完一级扫描后，质谱随即通过四极杆，选择特定的肽段离子，经过C-trap进入多级离子通道（Ion Routing Multipole），通过高能碰撞解离（high energy collision dissociation，HCD）将肽段离子的肽键随机断裂形成b/y离子，返回C-trap之后，离子被注入 Orbitrap进行二级质谱分析（MS/MS Analysis）。


如果是DDA扫描模式，会根据本次扫描循环中采集到的一级谱图，选择信号较高的肽段离子依次破碎采集二级谱图。如果是DIA扫描模式，则会根据预设的质荷比窗口，选择一定质荷比范围内的所有肽段离子进行破碎和采集二级谱图；而若是PRM扫描模式，则是选择确定好的特定质荷比的肽段离子进行破碎和采集二级谱图（（视频仅供参考学习））。


https://www.zhihu.com/video/1583504727660355584
质谱检测完整的数据采集过程由很多扫描循环组成，每个样品的检测总时间与其串联的液相色谱中样品洗脱梯度时间保持一致。如下图DDA扫描模式所示，每个扫描循环会采集一张一级谱图和数十张二级谱图。



（数据依赖采集，DDA）

总结
本篇承接上一讲的样品制备过程，主要向大家介绍了蛋白质组学研究中的重要环节——质谱检测，该环节的质控好坏很大程度上将影响蛋白鉴定的多少和定量结果的准确与否。质谱检测分为液相部分的样品引入和质谱部分的扫描分析，本篇以Orbitrap Exploris 480为例，着重介绍了质谱仪的数据采集过程。近年来质谱仪器硬件及其采集方式方法在不断地更新换代，在传统的3D蛋白质组学（即利用色谱-质谱获得的保留时间（Retention time）、质荷比（m/z）、离子强度（Intensity）3个维度的信息，辅助完成物质的定性定量）的基础上，还进一步开发出可采集离子淌度（ion mobility）信息辅助样品分离和蛋白定性定量的4D蛋白质组学，进一步提高了针对复杂样品、微量样品或修饰鉴定等特殊需求样品的检测深度和灵敏度。下一篇将介绍质谱检测的下一个环节——数据库搜索。

队长是我

1952年12月，“伦敦烟雾事件”致4000多人死亡。

空气污染是当今社会不可忽视的环境问题，微米级细颗粒物更在其中扮演重要角色。

有机气溶胶（Organic Aerosol, OA）颗粒约占大气微米级颗粒物的20-90％，大部分是通过挥发性有机化合物氧化形成的次级有机气溶胶（Secondary Organic Aerosol, SOA），为当今大气污染防控重点对象。

大气 OA 粒子由数百至数千种有机物组成，具不同性质、溶解度、极性和挥发性。在表征其复杂的分子组成时仍面临诸多挑战和困难，一些潜在的具较强生物毒性的未知组分可能会被忽略。

实时直接分析质谱（DART-MS）是一种大气压广谱性软电离技术，可对气态、液态和固态样品实时原位表征，适合各种极性的化合物，已广泛应用于爆炸物检测、法医分析、食品分析、临床检验、药物研究、以及 OA 颗粒分析等。

DART-MS 在大气化学中得到越来越多的应用。已有文献证明，DART-MS 可探测几纳米的表层，用于研究反应过程中颗粒的体积和界面区域；使用 DART-MS 研究 O3 与载样玻棒尖端包覆的多环芳烃薄膜的非均相反应；DART-MS 还应用于离线分析 C12 烷烃光氧化 SOA 组成等。

本文报道 DART-MS 在线应用于两种不同的空气悬浮颗粒物实验室模型系统：（1）亚微米二羧酸（C3-C7）与气相三甲胺（TMA）或丁胺（BA）的反应颗粒；（2）倍半萜 α-雪松烯（C15H24）臭氧化产物中 SOA 颗粒的研究。

01
二元酸颗粒与气相胺的反应
Reaction of diacid particles with gas-phase amines




图1、用于研究二元酸颗粒与气相胺反应的实验装置示意图。

以 DART 离子源（IonSense）串联三重四极杆质谱仪（QQQ）在线测量胺反应的二酸颗粒或 α-雪松烯 SOA 颗粒的化学组成。DART 出口与 MS 离子入口相距5 mm，相对角度为180°（图1），DART 离子化气为 He，流速3.1 L/min，源温度设为350℃；DART 出口端的栅电极电压为350 V。




图2、二酸颗粒与气相胺反应时的奇偶交替效应，奇碳二酸颗粒比偶碳更易反应。图示有丙二酸（C3），琥珀酸（C4），戊二酸（C5），己二酸（C6）和庚二酸（C7）。




图3、不同粒子流温度（TPS）下，C3-C7二酸颗粒与（a）丁胺和（b）三甲胺的反应表面积归一化分数（Fp）表明其形成过程没有明显的温度依赖性。推测胺反应仅限于表层，气固相互作用时，TPS 探测到的表层足够深，可以检测到整个颗粒结合基。


通过比较 TPS=23℃ 下测得的胺与二酸的 DART-MS 信号强度比值与已知的胺-二酸标准液的信号强度比值，可估算反应中胺与二酸的摩尔比（RB/A）。如表1所示，TMA 和 BA 与二酸反应的 RB/A 值与 Fp 趋势相似（图2）。

表1：






图4、DART-MS 探测的典型胺结合二元酸粒子示意图。

02
α-雪松烯 SOA 粒子的表征
Characterization of α-cedrene SOA particles


利用 DART-MS 测量不同 TPS 下 α-雪松烯臭氧分解产生的 SOA 颗粒，可详细研究有机颗粒中的复杂组成。与其他技术相比，DART-MS 更能直观测定颗粒生长的不同程度下的成分差异。


图5显示了在 TPS = 23℃（图5a 和 c）下，在 SOA 颗粒的质谱图中观察到的离子信号主要由低分子量产物（LMW）决定（m/z 200-350）。但是，在 TPS=125℃ 时，高分子量产物 HMW （m/z 420-580）以及大多数 LMW 的信号强度显着增加（图5b 和 d）。




图5、表面加权几何平均直径为21 nm 和28 nm 的 α-雪松烯 SOA 粒子在 TPS=23和125℃ 下的 DART-MS 谱图。

结果表明：
DART-MS 已成功应用于亚微米二酸颗粒与气相胺反应的实时研究和 α-雪松烯臭氧化生成 SOA 颗粒化学组成的在线测定。C3-C7 二元酸粒子对 TMA 和 BA 的反应表现出奇偶碳数的明显交替。使用已知的胺-二酸混合物进行标定，可确定反应粒子中碱与二酸的比率。粒子在不同温度下的汽化允许 DART-MS 基于其挥发性对 SOA 颗粒的异构进行表征。

这项研究结合先前的工作证明 DART-MS 是 ESI-MS 和其他质谱技术的强有力补充，应用于分析与大气相关的复杂体系。结合温度研究，它可活化空间异质颗粒的深度分子信息，并能区分不同挥发性的同分异构化合物。

● 参考文献
Yue Zhao, Michelle C. Fairhurst, et al. New insights into atmospherically relevant reaction systems using direct analysis in real-time mass spectrometry (DART-MS), Atmos. Meas. Tech., 10, 1373-1386, 2017
doi:10.5194/amt-10-1373-2017

清风寡欲

质谱仪种类很多，不同类型的质谱仪主要差别在于离子源。离子源的不同决定了对被测样品的不同要求，同时，所得信息也不同。质谱仪的分辨率同样十分重要，高分辨质谱仪可给出化合物的组成式，对于未知物定性至关重要。因此，在进行质谱分析前，要根据样品状况和分析要求选择合适的质谱仪。
目前，有机质谱仪主要有两大类：
气相色谱-质谱联用仪与液相色谱-质谱联用仪，现就这两类仪器的分析方法叙述如下：

GC-MS分析条件的选择

在GC-MS分析中，色谱的分离与质谱数据的采集同时进行，为了使每个组分都得到分离和鉴定，必须设备合适的色谱和质谱分析条件：
色谱条件包括色谱柱类型（填充柱或毛细管柱），固定液种类，汽化温度，载气流量，分流比，温升程序等。
设置原则是：
一般情况下均使用毛细管柱，极性样品使用极性毛细管柱，非极性样品采用非极性毛细管柱，未知样品可先用中等极性毛细管柱，试用后再调整。当然，如果有文献可以参考，就采用文献所用条件。 质谱条件包括：
电离电压，电子电流，扫描速度，质量范围，这些都要根据样品情况进行设定。为了保护灯绿和倍增器，在设定质谱条件时，还要设置溶剂去除时间，使溶剂峰通过离子源之后再打开灯绿和倍增器。在所有的条件确定之后，将样品用微量注射器注入进样口，同时，启动色谱与质谱，进行GC-MS分析。

GC-MS数据采集

有机混合物样品用微量注射器由色谱仪进样口注入，经色谱柱分离后进入质谱仪离子原在离子源被电离成离子。离子经质量分析器，检测器之后即成为质谱仪信号并输入计算机。样品由色谱柱不断流入离子源，离子由离子源不断进入分析器并不断得到质谱，只要没定好分析器扫描的质量范围和扫描时间，计算机就可以采集到一个个的质谱。如果没有样品进入离子源，计算机采集到的质谱各离子强度均为0。当有样品过入离子源时，计算机就采集到具有一定离子强度的质谱。并且计算机可以自动将每个质谱的所有离子强度相加。显示出总离子强度，总离子强度随时间变化的曲线就是总离子色谱图，总离子色谱图的形状和普通的色谱图是相一致的，它可以认为是是用质谱作为检测器得到的色谱图。
质谱仪扫描方式有两种：全扫描与选择离子扫描
全扫描是对指定质量范围内的离子全部扫描并记录,得到的是正常的质谱图,这种质谱图可以提供未知物的分子量和结构信息。可以进行库检索。
质谱仪还有另外一种扫描方式叫选择离子监测（Selection Moniring SIM）。此种扫描方式是只针对选定的离子进行检测，而其它离子不被记录。
它的最大优点：
一是对离子进行选择性检测，只记录具有特征的、感兴趣的离子，不相关的，干扰离子统统被排除；
二是选定离子的检测灵敏度大大提高。在正常扫描情况下，假定一秒钟扫描2～500个质量单位。那么，扫过每个质量所花的时间大约是1/500秒，也就是说，在每次扫描中，有1/500秒的时间是在接收某一质量的离子。在选择离子扫描的情况下，假定只检测5个质量的离子，同样，也用一秒，那么，扫过一个质量所花的时间大约是1/5秒。也就是说，在每次扫描中，有1/5秒时间是在接收某一质量的离子。因此，采用选择离子扫描方式比正常扫描方式灵敏度可提高大约100倍。由于，选择离子扫描只能检测有限的几个离子，不能得到完整的质谱图，因此，不能用来进行未知物定性分析，但是，如果选定的离子具有很好的特征性，也可以用来表示某种化合物的存在。选择离子扫描方式最主要的用途是定量分析，由于它的选择性好，可以把由全扫描方式得到的非常复杂的总离子色谱图变得十分简单。消除其它组造成的干扰。

GC-MS得到的信息

总离子色谱图




计算机可以将采集到每个质谱的所有离子相加得到总离子强度，总离子强度随时间变化曲线就是总离子色谱图（图9.21），总离子色谱图的横座标是出峰时间，纵座标是峰高。图中每个峰表示样品的一种组份，由每个峰可以得到相应化合物质谱图；峰面积与该组份含量成正比，可用于定量。由GC-MS得到的总离子色谱图与一般色谱仪得到的色谱图基本上一致，只要所用色谱柱相同，样品出峰顺序便相同。其差别在于，总离子色谱图运用的检测器是质谱仪，而一般色谱图所用的检测器是氢焰、热导等，两种色谱图中各成分的校正因子不同。
质谱图由总离子色谱图可以得到任何一种组分的质谱图。一般情况下，为了提高信噪比。通常由色谱峰峰顶处得到相应质谱图，但如果两个色谱峰具有相互干扰，应尽量选择不发生干扰的位置而得到质谱，或通过扣本底消除其他组分影响。

库检索
得到质谱图后可以通过计算机检索对未知化合物进行定性。检索结果可以给出几个可能的化合物，并以匹配度大小顺序排列出这些化合物的名称、分子式、分子量和结构式等。使用者可以根据检索结果和其它的信息，对未知物进行定性分析。目前，GC-MS联用仪有几种数据库。应用最为广泛的有NIST库和Willey库，前者目前有标准化合物谱图13万张，后者有近30万张。此外，还有毒品库、农药库等专用谱库。
质量色谱图（或提取离子色谱图）
总离子色谱图是将每种质谱的所有离子加和得到。同样，由质谱中任何质量离子也可得到色谱图，即，质量色谱图。质量色谱图是由全扫描质谱中提取出一种质量的离子而得到的色谱图。因此，又称为提取离子色谱图。假定做质量为m的离子质量色谱图，如果某化合物质谱中不存在该种离子，那么该化合物就不会出现色谱峰。一个混合物样品中可能只有几个甚至一个化合物出峰。利用该特点可识别具有某种特征的化合物，也可通过选择不同质量的离子做质量色谱图，使正常色谱不能分开的两个峰实现分离，以便进行定量分析（见图9.22）。由于，质量色谱图是采用一种质量的离子作色谱图。因此，进行定量分析时也需要使用同一离子得到质量色谱图测定校正因子。




选择离子监测（Selection monitoring，SIM）
一般扫描方式是连续改变Vrf，使不同质荷比的离子顺序通过分析器到达检测器，而选择离子监测则是对选定离子进行跳跃式扫描。采用该种扫描方式可提高检测灵敏度。由于该种方式灵敏度高，因此，适用于量少且不易得到的样品分析。利用选择离子方式不仅灵敏度高，而且选择性好，在许多干扰离子存在时，利用正常扫描方式所得信号值可能很小，噪音可能很大，但用选择离子扫描方式，只选择特征离子，噪音会变得很小，信噪比大大提高。在对复杂体系中某一微量成分进行定量分析时，常采用选择离子扫描方式。由于，选择离子扫描不能得到样品全谱。因此，该种谱图不能进行库检索，利用选择离子扫描方式进行GC-MS联用分析时，得到的色谱图在形式上类似质量色谱图，但实际上，二者有巨大的差别。质量色谱图利用全扫描方式得到。因此，可得到任何一个质量的质量色谱图；选择离子扫描是选择了一定m/z离子。扫描时选定哪个质量，就只能有那个质量的色谱图。如果二者选择同一质量，那么，用SIM灵敏度要高得多。

GC-MS定性分析

目前，色质联用仪数据库中，一般贮存有近30万个化合物标准质谱图。因此，GC-MS最主要的定性方式是库检索。由总离子色谱图可以得到任一组分的质谱图，由质谱图可以利用计算机在数据库中检索。检索结果，可以给出几种最可能的化合物。
包括：化合物名称、分子式、分子量、基峰及可靠程度。表4是由计算机给出的某未知物谱图检索结果。
表4：某未知化合物检索结果





利用计算机进行库检索是一种快速、方便定性方法，但是，在利用计算机检索时应注意如下几个问题：

数据库中所存质谱图有限，如果未知物是数据库中没有的化合物，检索结果也给出几个相近的化合物。显然，这种结果是错误的。由于质谱法本身的局限性，一些结构相近的化合物其质谱图也相似，这种情况也可能造成检索结果不可靠。
由于，色谱峰分离不好以及本底及噪音的影响，使得到的质谱图质量不高，这样所得到的检索结果也会很差。
因此，在利用数据库检索之前，应首先得到一张很好的质谱图，并利用质量色谱图等技术判断质谱中有没有杂质峰；得到检索结果之后，还应根据未知物的物理、化学性质以及色谱保留值、红外、核磁谱等综合考虑,才能给出定性结果。

GC-MS定量分析

GC-MS定量分析方法类似于色谱法定量分析，由GC-MS得到的总离子色谱图或质量色谱图，其色谱峰面积与相应组分的含量成正比，若对某一组份进行定量测定，可以采用色谱分析法中的归一化法、外标法、内标法等不同方法进行。
这时，GC-MS法可理解为将质谱仪作为色谱仪检测器。其余均与色谱法相同，与色谱法定量不同的是，GC-MS法除了可利用总离子色谱图进行定量之外，还可利用质量色谱图进行定量，这样做可最大限度去除其它组份的干扰。
值得注意的是：
质量色谱图由于运用一种质量离子做出，它的峰面积与总离子色谱图具有较大差别，在进行定量分析过程中，峰面积与校正因子等都需要使用质量色谱图。。。
为提高检测灵敏度及减少其它组分的干扰，在GC-MS定量分析过程中质谱仪经常采用选择离子扫描方式。对于待测组分，可选择一个或几种特征离子，而相邻组份不存在这些离子。用该种方式得到的色谱图，待测组份不存在干扰。同时，具有较高的灵敏度。用选择离子得到的色谱图进行定量分析，具体分析方法与质量色谱图类似，但其灵敏度比利用质量色谱图高，这是GC-MS定量分析中经常采用的方法。