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一、实验前的准备
1、要了解你的实验室环境,了解你的实验环境中可能存在的隐患:是否有同事在进行DNA抽提?是否实验室人员众多?
2、要了解你可以使用的设备:离心机是否可以低温操作?破碎、匀浆的条件怎样?
3、要了解抽提RNA的目的。
4、要了解样品的采集、制备、保存的条件,了解样品的特点。
有了充分的了解后,才能正确选择合适的方法/试剂,提高抽提的成功率。
二、RNA抽提“三大纪律八项注意”
纪律一:杜绝外源酶的污染。
注意一:严格戴好口罩,手套。
注意二:认真处理实验所涉及到的试剂、耗材、环境。
纪律二:阻止内源酶的活性。
注意三:选择合适的匀浆方法。
注意四:选择合适的裂解液。
注意五:控制好样品的起始量。
注意六:匀浆操作快速而彻底。
纪律三:明确自己的抽提目的
注意七:任何裂解液系统在接近样品最大起始量时,抽提成功率急剧下
降。
注意八:RNA抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功,而不
是得率。
三、RNA抽提的10大窍门
1:快速阻止Rnase活性–样品收集后快速冷冻,裂解时快速操作灭活Rnase。
2:选择合适的抽提方法–高核酶含量的组织,脂肪组织最好用含苯酚的方法。
3:预判质量要求– Northern,cDNA文库构建对完整性要求高,RT-PCR, RPA (Ribonuclease protection assay)对完整性要求不是很高。RT-PCR对纯度(酶抑制物残留)要求很高。
4:彻底匀浆是提高得率和降低降解的关键。
5:检查 RNA的完整性–电泳检测,28S:18S =2:1是完整的标志,1:1对大部分实验也是可以接受的。
6:去除DNA –用于RT-PCR, array analysis最好用Dnase I去除DNA。
7:降低外源酶的污染–不能从外面又导入酶。
8:低浓度的核酸浓缩时,要加入助沉淀试剂。但要防止助沉淀剂含酶及DNA污染。
9:彻底溶解RNA,必要时可以65C加热5分钟。
10:合适的保存方法–短时间可以–20C保存,长期请保存于–80C。
四、提高RNA得率的方法
1:使用更有效的破碎/匀浆方法。RNA如果不能被有效释放出来,得率是会降低的。液氮捣碎、酶消化破壁(Lysozyme/Lyticase)、电动匀浆器匀浆,虽然麻烦,但都是获得高得率的有效手段。
2:抽提试剂的更换。假如得率低不是由匀浆方法不彻底引起,则可能是所使用的试剂的裂解能力差导致。最合理的做法是:使用更多的裂解液;用完后换厂家。另外,可以改用不使用苯酚/氯仿抽提的试剂/方法;使用苯酚/氯仿抽提的方法,由于不可能全部取出上清,RNA的损失是比较大的。
3:延长沉淀时间。如果核酸浓度低,采取低温沉淀、并延长沉淀时间,可以获得非常好的效果。
五、不同抽提总RNA方法的比较
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