免疫化学发光并非万能，单分子免疫检测未来可期（上篇）

检验之星

前言
化学发光技术已经成为当前免疫诊断市场中最重要的检测技术。自上世纪70年代诞生以来，尽管随着检测设备全自动化水平以及检测元件精密度、试剂生产保存工艺的发展，化学发光技术的检测灵敏度有了显著的提升，然而究其本质而言，无论是酶促发光、直接发光或是电化学发光，化学发光技术在检测原理上在过去的近50年里并没有得到任何改变。可以认为在自动化水平已经达到相当高程度的今天，化学发光技术在现有抗体亲和力水平的前提下，已经接近了其检测能力的极限。
免疫诊断市场在新型标志物或新型诊断市场上的开拓，可能需要一种从检测原理层面进行变革的新型免疫诊断技术——单分子免疫检测。
  本文将分为以下几个部分探讨下一代免疫诊断技术——单分子免疫检测对现有免疫诊断市场的影响以及在体外诊断市场普及应用的可行性。
（1）  化学发光发展现状
（2）  单分子检测技术——生物检测技术的极限标尺
（3）  从化学发光到单分子免疫检测有多远
（4）  数字PCR技术的发展给单分子免疫检测的启示
（5）  单分子免疫检测技术发展现状
（6）  单分子免疫检测平台技术分析
（7）  单分子检测技术是分子检测与免疫检测平台统一化的可行桥梁
（8）  超低成本单分子免疫检测技术实现的可能性

1.    化学发光技术发展现状

当今全球范围内，免疫诊断市场呈现以大型全自动化学发光为主流，多种检测技术原理、检测平台形式多样化发展的局面。
国内高端免疫诊断市场中，大型全自动化学发光设备基本处于罗氏、雅培、西门子等国际巨头企业垄断状态。尽管迈瑞、新产业等国内龙头企业近几年得到迅速发展，但是短期内依然难以改变目前市场份额分配的局势。
而在POCT细分领域，则有以梅里埃VIDAS、三菱PATHFAST、星童Pylon等为代表的小型全自动单人份POCT试剂条，以美艾利尔、广州万孚、南京基蛋为代表的免疫层析试纸，以及雅培iSTAT、华迈兴微极光系列、理邦的磁敏免疫产品为代表的微流控POCT产品。化学发光技术凭借其绝对领先的灵敏度、准确性与精密度，无疑是当前免疫诊断技术中最可靠的检测方法，它贯穿了从全自动大型设备，到小型全自动POCT设备甚至到微流控POCT的全线免疫诊断产品。
然而，当我们对免疫诊断技术发展历史进行梳理时候，就会发现化学发光并不是一个新技术。化学发光技术从上世纪70年代中期诞生，到上世纪末以及本世纪初由于罗氏、雅培、西门子等企业通过收购或自主研发推出各大早期化学发光平台而受到广泛关注，再到近十年随着自动化技术的迅速发展，替代了酶联免疫成为免疫诊断市场最核心的技术，已经经历了超过40年的时间。
而在这40年里，无论是酶促化学发光、直接化学发光或是电化学发光，化学发光的检测技术却并没有任何检测原理层面上的改变，现有的化学发光检测在灵敏度、准确度的提升几乎是完全依赖于自动化设备精密度的提升以及发光分子衍生物结构上的改造。

在过去化学发光技术快速发展的近二十年里，我们习惯了依赖于自动化技术快速发展给免疫诊断市场带来的精确度与可靠性的提升，却也习惯了化学发光方法在检测技术原理上给我们带来试剂或设备层面的各种枷锁，形成了定式思维，难以在检测原理层面实现革新。

2.    单分子检测技术——生物检测技术的极限标尺

1967年法国数学家B.B.Mandelbrot在其分形理论中提出了“英国的海岸线有多长”的问题。该理论认为，英国海岸线的长度取决于测量尺子的精确程度。随着尺子逐渐变小，精确程度逐渐提高，测量所得的海岸线长度将无限增大。与“英国海岸线有多长”的问题相似，我们对生命科学领域的认知范围也是随着各种生物检测技术灵敏度和精确程度的提升而逐渐提升的。
不同的是，在生物分析检测领域，尺子的最小尺寸似乎是有极限的——单分子水平。包括核酸、蛋白质或是多糖在内的绝大部分生物分析系统，当检测对象超越了分子水平到达原子水平，检测都将失去其本来的意义。单分子水平的生物标志物的研究，为前沿科学领域、医疗诊断领域都提供了难以估量的学术价值与市场机会。

3.    从化学发光到单分子免疫检测有多远



图1 吖啶酯发光过程中的光子方向随机性

现有的化学发光技术是一种自上而下的检测逻辑，它通过测量溶液整体光学信号强度换算分子浓度。以吖啶酯化学发光为例，化学发光设备通常是以光电倍增管（PMT）直接检测溶液整体释放的光子数，通过积分或发光强度的形式来实现定量检测。现有的化学发光体系为了提高吖啶酯化学发光检测体系的灵敏度，除了抗体亲和性因素的影响，更为简单直接的方法就是提高反应体系的整体体积，从而在一定样品浓度下提高检测液中结合的吖啶酯分子的总数，来提高被PMT检测到的光子总数。然而这种检测形式并不适合于单分子水平的检测。

要实现单分子免疫检测必须要实现两个前提：
（1）单分子信号检测
（2）单分子信号溯源。
前者是单分子检测的基础条件，而后者则是通过单分子计数实现定量检测的必须条件。

现有的化学发光技术不可能实现单分子免疫检测，其检测灵敏度下限的瓶颈来源于分子层面的不确定性。吖啶酯分子在遇到发光激发底物时，会在极短的时间内释放数个光子，其后结构迅速遭到破坏失去发光能力。由于吖啶酯分子在释放光子时，光子方向是不可控的，而作为发光检测设备的核心部件光电倍增管却是有方向性的（图1）。这就使得单个吖啶酯释放的少数几个光子不能确保被PMT检测到（不满足第一点前提条件），同时PMT上捕获的光子信号也不可能对溶液中单个吖啶酯分子进行溯源（不满足第二点前提条件）。

当样品中的抗原分子浓度低到一定程度时，PMT能够捕获到光子数量的不确定性将呈指数级提高，导至检测信号完全被埋没于背景噪音中，失去定量检测能力。同样的问题也存在于电化学发光和酶促化学发光体系中。

因此，在设备自动化技术已经发展到相当高水平的今天，现有的化学发光技术检测灵敏度已经接近于其理论上的检测极限水平。

对于现有的免疫检测体系而言，若需要以更高灵敏度的检测方法去探寻新的生物标志物，或是开发新型免疫诊断市场方向，势必需要在检测原理层面上进行技术本质的革新。

4.    数字PCR技术的发展给单分子免疫检测的启示


图2 数字PCR工作原理
（PNASAugust 3, 1999 96 (16) 9236-9241; DOI: pnas.96.16.9236）

在过去的近二十年里，数字PCR技术快速发展可以认为是分子诊断领域最令人振奋的技术进步。数字PCR技术（DigitalPCR）最早由Vogelstein于1999年提出，通过在96/384孔板中极限稀释DNA模板进行验证（图2）。
2003年Dressmam等发明了BEAMing技术，将磁珠、模板、引物等分散到小液滴当中，进行单分子级别的扩增，再利用磁珠对单分子扩增产品进行结合回收分析。
2006年Fluidigm推出了第一台基于微阵列芯片的商品化数字PCR系统。同年QuantaLife推出液滴式数字PCR技术，并于2011年被Bio-Rad公司以1.62亿美元收购，成为后来众所周知的QX-100系统，正式掀起了数字PCR在资本市场中的热潮。
2013年Bio-Rad推出升级机型QX-200系统。同年，LifeTechnologies推出了基于微阵列液滴芯片的QuantStudio3D系统，成为QX-200系统主要市场竞争对手。此后，受益于资本市场对数字PCR下一代分子诊断技术地位的认可和推动，国内外涌现了一大批各式数字化PCR技术平台。
2016年，法国Stilla公司推出了NaicaCrystal平台，首次推出了三色检测通道的数字PCR系统。2017年，伯乐完成对竞争对手RainDanceTechnologies的收购，基本完成在液滴式数字PCR细分技术领域的垄断。
数字化PCR技术的发展不仅推动了现有的分子诊断体系的进步，更为将来分子诊断市场在精准医学检测领域，例如基因组拷贝数突变、低丰度DNA模板检测、二代测序辅助建库、肿瘤治疗伴随检监测、稀有致病菌检测等，提供了必要的技术支持。
数字PCR是当前市场上最具有代表性的单分子检测技术，它是一种典型的信号放大依赖型的单分子检测技术，其本质是单分子独立的信号放大、识别与提取。数字PCR通过将样品分散到数万至数十万个独立反应单元（液滴或阵列），在每个反应单元中对模板分子进行独立扩增。扩增后通过测量反应单元荧光信号强度判断该单元是否含有模板分子，再根据含有模板分子的反应单元所占比例来换算样品中模板分子的浓度。
数字PCR的核心理论依据是泊松分布（Poissondistribution）。泊松分布是一种统计与概率学里常见到的离散概率分布，它描述了单位时间内随机事件发生次数的概率。对于数字PCR检测体系则是描述了在一定模板浓度的前提下（λ表示平均每个微单元平均出现的模板个数），在每个固定体积的微反应器（液滴或微阵列单元）中出现模板个数的概率。根据泊松分布公式，当目标浓度稀释到极限，λ远小于1趋近于0时，趋近于0，P（1）趋近于λ，故可通过绝对计数来实现绝对定量。


目前，市场上比较具有代表性的几个数字PCR技术平台及其主要技术特点如下表所示：


表1 几个具有代表性的数字PCR技术平台特点汇总

数字PCR技术对现有传统分子诊断技术的冲击，以及技术层面上单分子检测的策略方法，让一些人注意到了将单分子检测技术应用到体外诊断领域中，占据最大市场份额的免疫诊断的潜力。尽管近几年国内数字PCR技术的开发与推广依然处于如火如荼的快速发展阶段，国外更具有先进性战略眼观的企业与资本市场早已将启动了单分子检测技术在免疫诊断市场的产业化转化。

2010年，参考数字PCR检测原理，DavidWalt与David Duffy团队开发了“DigitalELISA”技术（Single-moleculeenzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolarconcentrations, Nature Biotechnology, volume28, pages595–599 (2010)）。该技术延续了数字PCR单分子检测逻辑，它以标记后的半乳糖苷酶催化底物产生荧光信号代替数字PCR过程中PCR进行信号扩增的过程，将标记有β半乳糖苷酶的单分子蛋白分散到高通量的微反应器中进行独立反应，通过对每个微反应器信号的检测和统计来实现单分子级别检测。

“DigitalELISA”技术的出现打破了业内对免疫检测技术检测灵敏度下限的认知，让业内意识到单分子免疫检测技术在医疗诊断市场产业化的可行性。其后，DavidWalt凭借“Digital ELISA”技术于美国成立Quanterix公司，推出单分子酶联免疫检测技术平台SiMoA。SiMoA一经面世便吸引了众多国内外业内人员和资本市场的关注，并在其后的几年内获得多伦高额的融资。

2015年，Merck公司收购Singulex公司SMC技术在生命科学研究领域的使用权（金额条件未披露），再次将单分子免疫检测技术推到资本市场的大舞台。而随着今年Merck公司主推的稳定性更好的第二代单分子蛋白检测平台SMCxPRO系统的大力推进，势必将引起一阵单分子免疫检测技术发展的热潮。

数字PCR技术的快速发展在技术层面上给了单分子免疫检测技术很好的启示和推动作用，它在过去几年里发展的历程也让我们意识到单分子检测作为下一代检测技术在体外诊断市场中势不可挡的发展趋势。

可以预测，如果说数字化PCR正处于体外诊断资本市场的风口之上，那么下一个进入体外诊断技术领域风口的有可能是单分子免疫检测技术。
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厦门宇测生物科技有限公司   官志超
作者简介：
官志超，厦门大学硕士。2009年师从杨朝勇教授正式进入实验室，从事于微流控芯片、数字化PCR、单分子蛋白检测、POCT新方法的研究。硕士期间以一作身份发表Angew.Chem. Int. Ed.（IF 12.1）两篇，Anal.Chem.（IF 6.0）一篇，Biomicrofluidics（IF 2.6）一篇，二作身份发表AMI（IF 8.0）一篇。2014年因研发的新技术获得投资，放弃ETH公派博士offer，投入创业，组建厦门佰盛特生物科技有限公司。作为公司副总经理负责新型POCT技术的研发、生产及医疗器械批文申报，具有丰富的研发、生产、管理和注册经验。18年因AstraSystem技术获得突破，独立组建团队，成立厦门宇测生物科技有限公司。

厦门宇测生物科技是国内首家从事于单分子免疫诊断技术产业化的高科技型企业，依托上海交通大学医学院分子医学研究院副院长杨朝勇教授实验室在数字单分子检测、POCT方面丰富的研发经验优势，公司目前已完成低成本、易操作的单分子免疫检测技术的研发和转化，将真正实现超低成本单分子免疫技术在医疗诊断市场的应用。
文章来自医业观察

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