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[分享] 染色体荧光原位杂交分析有了解的吗?谢谢。

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发表于 2024-11-6 23:35 | 显示全部楼层 |阅读模式

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我母亲71岁,前几天因肠黏连导致小肠内疝,引起肠梗阻,后住院行腹腔镜手术,将连黏处松解,并未切除肠管。出院时发现有染色体荧光原位杂交分析6次,一共1200元,需全部自费,请问下:这种分析是干什么的?肠梗阻需要测这个吗?谢谢
原文地址:https://www.zhihu.com/question/49494761
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发表于 2024-11-6 23:36 | 显示全部楼层
概述

在类器官的培养过程中,如果我们想了解类器官的增殖及凋亡状态,可以通过对活细胞和死细胞进行荧光染色,通过荧光显微镜拍照观察。
Calcein-AM是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂,发绿色荧光 (Ex=490nm, Em=515nm)。因其在传统的Calcein(钙黄绿素)基础上引入乙酰甲氧基甲酯(AM)基团,增加了疏水性,使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后,Calcein-AM(本身不发荧光)被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein,从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。与其它同类试剂(如BCECF-AM和CFDA)相比,由于Calcein-AM细胞毒性极低,是最适合用于活细胞染色的荧光探针,而且不会抑制任何的细胞功能,如增殖和淋巴球的趋化性。        
由于死细胞缺乏酯酶,Calcein-AM仅用于对活细胞的细胞生存能力测试和短期标记。因此,Calcein-AM常常与死细胞荧光探针如碘化丙啶(PI)等联合使用,同时进行活细胞和死细胞的荧光双重染色。碘化丙啶(Propidium iodide, PI)不能穿过活细胞的细胞膜,仅能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核,并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光(Ex=535nm, Em=617nm),因此PI仅对死细胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490nm激发,因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。而用545nm激发,仅可观察到死细胞。
原理

本试剂盒的工作原理就在于Calcein-AM和PI的双重染料,来进行活细胞和死细胞的双重染色标记,从而进行活细胞和死细胞水平的分析。根据我司优化的实验体系,以24孔板,每孔25uL类器官基质胶凝聚物为例,每孔添加500uL染色工作液进行染色。

活细胞/死细胞双染试剂盒(abs50056)
组分名称规格保存
ACalcein-AM Solution(2mM)50μL-20℃避光干燥保存
BPI Solution(1.5mM)150μL-20℃避光干燥保存
C10×Assay Buffer50mL-20℃保存,经常使用可放在4℃保存。
实验步骤

一、工作液的配制:

1、1×Assay Buffer(反应缓冲液)的配制 从低温冰箱内取出10×Assay Buffer,根据单次用量无菌条件取出适量,用去离子水(dH2O)做10倍稀释以得到1×Assay Buffer。
2、1×染色工作液的配制
(1)先将低温保存的Calcein-AM溶液(2mM)和PI溶液(1.5mM)回到室温20-30min。 注意:第一次使用可对母液进行分装,以减少反复冻融次数。
(2)取5μL Calcein-AM溶液(2mM)和15μL PI 溶液(1.5mM)加入5mL 1×Assay Buffer,充分混匀。此时得到Calcein-AM的工作液浓度为2μM,PI的工作液浓度为4.5μM。
注意:由于不同种类器官的最佳染色条件不同,初次实验建议做梯度实验,以确定Calcein-AM和PI的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最低的探针浓度得到最好的荧光结果。可以使用以下方法来优化得到两种荧光染料的最佳工作浓度。

a. 用0.1%皂素或者0.1-0.5%地高辛孵育类器官1h,或者用70%乙醇孵育类器官1h,从而制备死类器官;
b. 用0.1-10μM的PI溶液进行死类器官染色,以得到仅仅对细胞核染色,而不会对细胞质染色的最佳工作浓度;
c. 用0.1-10μM的Calcein-AM进行死类器官染色,以得到不会对细胞质染色的最佳工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色,去观察活细胞是否能被染色。
二、染色步骤:

以24孔板,每孔25uL类器官基质胶凝聚物为例,检测时只需弃除类器官培养液,保留孔板内25μL类器官基质胶凝聚物,加入染色工作液即可。
1、将类器官培养基吸弃,加入PBS清洗2-3遍,以充分去除残留的酯酶活性,然后弃除PBS;
2、每孔加入500μL染色工作液,混匀,37℃孵育1h;
3、荧光显微镜下使用490±10nm激发滤片同时检测活细胞(黄绿色荧光)以及死细胞(红色荧光)。另外,使用545nm的发射滤片仅能观察到死细胞。也可以直接在荧光酶标仪下使用合适的滤片进行检测。
注意事项
1、由于Calcein-AM对湿度非常敏感,若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后,必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量,分装密封保存。
2、由于Calcein-AM的稳定性比较差,此染色工作液必须现配现用,并且在当天用完。
3、碘化丙啶(PI)有一定的致癌性,操作时一定要注意防护。若接触到皮肤,需要立即用自来水清洗。
4、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
染色效果图展示

一、人肝细胞癌类器官明场图









人肝细胞癌类器官扩增过程(由少到多)

二、人肝细胞癌类器官活死染色视频


https://www.zhihu.com/video/1768633868541026304
三、人肝细胞癌类器官活死染色图





人肝细胞癌类器官活细胞、死细胞、活死细胞染色合并图



人肝细胞癌类器官活死细胞染色合并图

今天讲解就到这了,大家如有实验问题,欢迎一起交流哦!

类器官培养产品推荐
货号品名规格
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发表于 2024-11-6 23:36 | 显示全部楼层
FISH:采用了已知序列的、特异性的单链核酸作为探针,标记了生物素或荧光素,在一定的温度和离子浓度下通过碱基互补配对法则,使得DNA-DNA原位杂交,采用荧光法显示,最终将DNA在细胞爬片、组织切片(石蜡切片or冰冻切片)的原始位置上标记出来的一种技术。
荧光原位杂交(FISH)
试剂和设备

  • 20X 柠檬酸钠缓冲液(SSC:3 M NaCl,0.3 M柠檬酸钠,pH 7,货号S6639
  • RNase A(货号R4642)100 µg/mL,2x SSC溶液
  • 胃蛋白酶(货号P6887) 40单位/ml,10 mM HCl溶液
  • 多聚甲醛,EM级(货号P6148),现制,4% w/v水溶液
  • 乙醇
  • 标记的探针。通过缺口平移随机引物或 A3803聚合酶链反应(如ADVANCE™缺口平移试剂盒)而对质粒DNA进行生物素-11-dUTP标记
  • 杂交混合液:50%甲酰胺(货号F7508)、10%硫酸葡聚糖(货号D8906)、0.1% SDS(货号L4390)、0.5-1.5 ng/µl标记的探针和300 ng/mL鲑鱼精子DNA(货号D7656),2x SSC溶液
  • 洗涤缓冲液:20%甲酰胺(货号F7508),0.1x SSC溶液
  • 检测缓冲液:0.2% Tween 20(货号. P1379),4x SSC溶液
  • 封闭缓冲液:5% 牛白蛋白(货号A3803),检测缓冲液溶液
  • 抗体或检测化合物(如链霉亲和素-Cy3,货号S6402),封闭缓冲液溶液
  • DAPI(货号D9542),2 µg抗荧光淬灭封片剂溶液。
  • 荧光显微镜、滤光片和可选的三带通滤波器(x58,Omega Optics)
  • 玻片(货号S8400
  • 用于孵育和杂交步骤的塑料盖玻片(从可高压灭菌的垃圾袋切下,如货号B4408
  • 热模块/ 改进的热循环仪
  • 用于洗涤步骤的科普林缸(货号S6016S5641S5891

操作流程
玻片制备
杂交
检测
玻片制备

  • 从任何细胞类型开始染色体制备(Z-Series Pumps)
  • 在37 °C下用200 µL RNase孵育1小时
  • 在2x SSC中洗涤玻片5分钟。重复。
  • 在10 mM HCl中漂洗玻片。
  • 在37 °C下用200 µL胃蛋白酶孵育10分钟。
  • 在去离子H2O中漂洗玻片。
  • 在2x SSC中洗涤玻片5分钟。重复。
  • 在多聚甲醛中固定玻片10分钟。
  • 在2x SSC中洗涤玻片5分钟。重复。
  • 在梯度乙醇中对玻片进行脱水:70%、80%、95%;每种2分钟。
  • 风干。
杂交

  • 每块玻片制备30 µl杂交溶液。加热至70 °C,维持10分钟后置于冰上。(Z-Series Pumps)
  • 每块玻片上加入30 µl杂交溶液并盖上塑料盖玻片。(Z-Series Pumps)
  • 在热模块上65-70 °C条件下对玻片进行变性5分钟。
  • 逐渐降温至37 °C。
  • 在湿度箱37 °C条件下杂交过夜。
检测


  • 在2x SSC中洗涤玻片以去除盖玻片。
  • 在洗涤缓冲液中40 °C条件下洗涤玻片5分钟。重复。
  • 在0.1x SSC中40 °C条件下洗涤玻片5-15分钟。
  • 在2x SSC中40 °C条件下洗涤玻片5-15分钟。
  • 将玻片冷却至室温。
  • 在检测缓冲液中平衡玻片5分钟。
  • 在封闭缓冲液中封闭20-30分钟。
  • 用50 µl 抗体或检测化合物孵育30-60分钟(如在封闭缓冲液中的5 µg/ml 链霉亲和素-Cy3)。
  • 在2x SSC中洗涤玻片5分钟。重复两次。
  • 用DAPI溶液复染10分钟。
  • 简短漂洗后在抗荧光淬灭封片剂中进行封片。
  • 用荧光显微镜进行分析。
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发表于 2024-11-6 23:37 | 显示全部楼层
一般都是检查癌症相关基因或染色体的,有些癌症会有相关基因或染色体的改变,可以通过此技术来检查,辅助诊断。
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发表于 2024-11-6 23:38 | 显示全部楼层
蟹蟹邀请。。
白菜医学生,不过知道这个是Fish技术,肿瘤遗传学内容,用于测定病人染色体,作为检测癌症技术手段。
为什么清除肠粘连要做这个,可能是为了排除癌症可能性。。我是猜的(。・ω・)
毕竟不临床不清楚,求真正的专科大神不吝赐教
题主是觉得有点过检查了吧,还没法回答这个呢。。
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