原位检测技术

检验之星

原位检测技术就是利用某些物质（如抗体、酶、核酸探针、凝集素等）将某一分子从细胞或组织内的众多生物分子中挑选出来，然后通过特异性酶反应显色或荧光显示等测定此分子在细胞组织原有位置上的分布范围和凝集程度，以判断此分子在细胞组织内的生理效应和病理意义。
原位检测技术可以分为原位杂交，原位测序，原为捕获，其中原位测序是目前空间转录组用的比较多的技术。


原位杂交

用已标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸中的互补序列杂交，从而对组织细胞中的核酸进行定性、定位和相对定量分析（直接简便的基因定位和表达）。
常用的探针标记物主要分为2种 1、放射性标记物--3H、32P、35S、125I等，特点：敏感性高，但半衰期短，有放射性污染，成本高；2、非放射性标记物--生物素、荧光素、地高辛素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等，特点：性能稳定，操作简便，成本低、耗时短，标记探针可较长时间的保存和使用


FISH
原位杂交技术（FISH)是采用了已知序列的、特异性的单链核酸作为探针，标记了生物素或荧光素，在一定的温度和离子浓度下通过碱基互补配对法则，使得DNA-DNA原位杂交，采用荧光法显示，最终将DNA在细胞爬片、组织切片(石蜡切片or冰冻切片)的原始位置上标记出来的一种技术。检测微生物、诊断实体癌症和血液癌症以及指导癌症治疗的有用的临床工具。
smFISH

单分子荧光原位杂交（smFISH）基于原位杂交技术，使用荧光标记的探针与目标RNA结合，形成荧光信号，通过显微镜观察可以观察到RNA的位置和数量。与传统的原位杂交技术不同的是，smFiSh可以检测单个RNA分子，因此可以更准确地定量RNA的表达水平和定位。smFISH还可以对RNA进行多重染色，即同时检测多个RNA分子的位置和表达水平。
1.获取新鲜组织；2.使用一组约48个探针(每个探针20bp)，来靶向同一mRNA转录本的不同区域，每个探针耦合到一个单一的荧光团；3.在带有荧光滤光片组的显微镜下，用自动光斑检测算法定量表达情况



smHCR
该技术是smFISH的改进，实现20倍的信号放大，实现0.5mm的厚组织检测
HCR是由Dirks和Pierce于2004年提出的一种简单有效的等温扩增过程。在典型的HCR中，引发剂触发两种DNA发夹之间的级联杂交事件，导致形成具有数十到数百个重复单元的刻痕双螺旋，直到发夹耗尽。
1.将组织切片固定在载玻片上；2.添加探针，设计与目标mRNA互补杂交的识别探针（每种基因设计20-40个探针）；3.探针组都带有HCR启动序列，不同基因的HCR启动序列不同，带有的荧光基团也不同；4.扩增阶段：HCR DNA分子发生级联反应产生的长链DNA结构；5.引入固定荧光的单核苷酸探针；6.信号可视化：在光学显微镜检测标记探针。



Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing

seqFISH

seqFISH是一种多路smFISH方法，通过连续几轮杂交、成像和探针剥离，多次检测单个转录本。然而，杂交轮数的增加需要增加smFISH探针的数量，这使得seqFISH既昂贵又耗时。
1.primary probe杂交：24个，对细胞中的所有RNA进行标记，每个probe长度在100nt左右（中间靶向RNA序列的，两侧均分成四段分别用来做4次barcode）；2.第一轮barcode：编码为左上角ⅠDNA，Ⅰ段有20种序列组成，进行20轮杂交（分别加入1-20号DNA探针），每次记录信号，洗掉探针，重复；3.第二轮barcode：编码为左下角ⅡDNA，操作如上；4.通过简单的更换成像滤片，就可以分别完成640nm 561nm以及488nm三个通道成像，第四轮是进行编码纠错；5.可以生成的编码有3×203种，需要一台共聚焦荧光显微镜就可以实现10000种基因的超多元成像。


MERFISH
为了弥补seqFISH的大量耗时，2015年发布了多重荧光原位杂交（MERFISH）技术。这种技术可以鉴定单个细胞中数千种RNA的拷贝数和空间定位。它利用组合标签、连续成像等技术来提高检测通量，并通过二进制条形码来抵消单分子标记和检测错误。2018年，MERFISH技术与扩张显微镜相结合，通过扩大RNA目标之间的距离，可以在没有光谱重叠的情况下使检测到的分子数量增加，可以在单细胞中同时检测多至500种基因甚至更多。
1.准备固定后的组织切片；2.编码探针杂交：用192个编码探针标记每个细胞的RNA，每个编码探针探针包含一个RNA靶向序列和两个不同的侧翼读出序列； 3.读出探针第一轮杂交：使用读出探针特异性地结合一级非荧光探针；4.被探针结合的位置会被点亮（标记为1），其余没有结合的不会亮（标记为0）；5.在N轮杂交使用C种颜色可达到2NC个基因；6.短荧光读出探针有效地剥离并从样品中冲走，引入一组新的读出探针测量一组新的基因；7.连续多轮的条形码杂交标记技术。


ClampFISH

ClampFISH被开发以提高在FISH中的效率和由此产生的弱信号响应。ClampFISH可以检测独特的核酸分子，并允许使用挂锁式探针，而无需酶的支持。
1.准备固定后的组织切片；2.添加ClampFISH探针（锁式探针）来靶向感兴趣的RNA序列，与靶RNA分子进行杂交；3.探针的末端使用正交点击化学连接起来；4.ClampFISH探针的主干包含2个landing pad区域，用来结合带有Cy5荧光探针位点的初级ClampFISH探针；5.依次添加Cy5荧光探针进行杂交（荧光信号增强）；6 信号可视化：在光学显微镜成像系统下检测标记探针


RNAscope

2011年，Advanced Cell Diagnostics推出了商业化的RNAscope芯片。该检测的核心是探针设计，两个相邻的 "Z-probes "与目标RNA转录物结合，形成所需的结合位点，供后续的放大分子杂交使用。2019年7月，同时检测RNA靶点的最大数量增加到12个。低倍数RNAscope还与成像质粒细胞仪（IMC）相结合，用金属标签代替荧光团对DNA树进行杂交。随后，将金属结合的抗体添加到同一组织切片，并进行金属丰度的质细胞测量，允许同时进行RNA和蛋白质评估。
1.组织切片固定在载玻片上；2.添加双Z探针（Z型探针底端是一段长约18～25个碱基的序列）与靶RNA分子进行杂交；3.依次杂交信号放大分子（Z型探针顶端是一段14个碱基长度的序列，两个探针引物的顶端序列共同构成一段 28个碱基长度的结合区，可与信号放大前体序列结合）和标记探针；4.信号可视化：在光学显微镜或者多光谱荧光成像系统下检测标记探针，每一个目标RNA分子以一个点状信号的形式呈现。


smCISH

1.固定样本切片；2.锁式探针通过碱基互补配对与目标RNA分子上的靶序列杂交；3.经过滚环扩增（RCA）合成重复靶序列的滚环产物（RCP）；4.在滚环扩增产物上杂交带有辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测探针，然后加入二氨基联苯胺（DAB）进行酶促显色反应；5.目标RNA就会形成棕色沉淀物，可在光学显微镜下检测，评估待测RNA的表达量。


asmFISH

德运康瑞，单分子RNA荧光原位杂交技术（asmFISH）。无需cDNA反转录操作，探针直接特异性靶向结合mRNA大大提高基因检出效率，该技术一次性可以同时验证1~4个靶标分子的表达位置，同样具备高特异性和高灵敏等优点，是单细胞测序和空间组学后续验证的选择。
1.固定样本切片；2.锁式探针通过碱基互补配对与目标RNA分子上的靶序列杂交；3.经过滚环扩增（RCA）合成重复靶序列的滚环产物（RCP）；4.在滚环扩增产物上杂交带有荧光标记的检测探针；5.在荧光显微镜下，获取空间位置，定量荧光强度。


原位测序

直接在原始环境中对RNA进行测序（短读数），放大信号：纳米DNA球，对目标序列的多轮扩增。
ISS

1.通过反转录将mRNA复制为cDNA ，将mRNA降解完毕；2.锁式探针与cDNA杂交，3.对于缺口靶向测序，末端的缺口位于连接靶向测序的碱基之上； 对于条形码靶向测序，携带条形码序列的挂锁探针的DNA环化通过连接进行。4.通过靶引物RCA扩增DNA环，产生RCP产物；5.锚定引物与靶序列(红色片段)杂交；6.读出探针由四个九聚体文库组成，具有八个随机位置(N)和一个固定位置(A、C、G或T)；每个库用四种荧光染料中的一种进行标记。7.对样品进行成像：每个RCP显示相对应的颜色，重复这些连接、成像和洗涤的步骤，直到读出所需数量的碱基。


HybISS

1.将mRNA转录本逆转录为cDNA；2.PLP探针共70nt：20 nt ID序列和20 nt通用锚序列；（一个基因有5个靶向位点，但barcode和anchor是相同的）3.正确识别cDNA，杂交；4.RCA滚环扩增形成滚动环扩增产物RCP；5.Bridge探针共39nt ：17bp与RCP结合，2bp随机碱基，20bp与荧光探针结合；（一个基因有4种bridge探针代表4种荧光）6.Readout探针共价修饰4种荧光基团上的一种；每轮成像后，洗脱Bridge探针和Readout探针，重复添加


FISSEQ

FISSEQ是一种非靶标的方法，即捕获所有种类的RNA。2019年，FISSEQ的研究小组又提出了原位转录组可及性测序（INSTA-Seq）。通过这种方式，规避了典型ISS方法对短读信息的限制。
1.将组织切片固定在载玻片上；2.原位进行逆转录，带有随机6碱基；3.加入环化酶，cDNA片段在60°C下环化；4.滚环扩增，得到富集产物；5.引入带有固定荧光的单核苷酸探针，根据图像分析，1个cycle确定2个碱基；6.通过7 cycle 的寡核苷酸探针掺入，实现原位测序。


STARmap

STARmap使用条形码挂锁探针，与靶标杂交，但通过添加第二个引物，针对挂锁探针旁边的位点，避免了逆转录（RT）步骤。这种方法避免了cDNA转换的效率障碍，并通过增加第二个杂交步骤来降低噪音。该方法最吸引的特点是能够对完整的组织样本进行3D分析，保留了细胞的方向性，而不仅仅是单一的2D层。但需要注意的是，这种能力只表现在100~150微米厚的切片和较少的目标数量上。
1.组织切片固定在载玻片上；2.SNAIL锁式探针（5碱基）通过碱基互补配对与目标RNA分子上的靶序列杂交；3.经过滚环扩增（RCA）合成DNA扩增子；4.使用水凝胶组化技术将DNA扩增子原位固定在组织细胞中（固定是为了保留转录本的原位信息，水凝胶的加入以及后续的蛋白/脂质清除提高了组织的透明度便于观察荧光信号）；5.通过SEDAL测序（6轮荧光成像）实现原位测序；6.信号可视化：根据6轮成像识别出基因所在位置及相对表达量。


ExSeq

该技术提供了独特的方法，可以了解哪些基因在细胞的哪些部位表达，更能了解基因表达如何收到细胞位置和附近细胞相互作用影响。
1.将mRNA转录本逆转录为cDNA；2.PLP探针共70nt：20 nt ID序列和20 nt通用锚序列；（一个基因有5个靶向位点，但barcode和anchor是相同的）3.正确识别cDNA，杂交；4.RCA滚环扩增形成滚动环扩增产物RCP；5.Bridge探针共39nt ：17bp与RCP结合，2bp随机碱基，20bp与荧光探针结合；（一个基因有4种bridge探针代表4种荧光）6.Readout探针共价修饰4种荧光基团上的一种；每轮成像后，洗脱Bridge探针和Readout探针，重复添加


1.样本固定，将RNA分子与Anchor结合；2.将样品嵌入可膨胀的凝胶材料中，再将RNA分子锚定在凝胶材料之中；3.使用FISSEQ技术对RNA分子进行逆转录和扩增；4.原位测序（读长较短，测5-30个碱基）；5.在原位测序结束后，回收cDNA，构建测序文库以用于二代测序；6.获得全长的转录组信息，同时与原位测序的数据进行remapping；7.短的原位测序数据作为空间码，获得转录组的空间位置信息；


IISS（德运康瑞）

基于扩增的单分子荧光原位杂交（asmFISH）的探针设计原理的改进原位测序（IISS）结合改进的组合探针锚连接（icPAL）化学，用于基于RCA的原位测序文库制备。
技术原理：1.基因的DLP探针设计：共45nt（每个基因3-5个探针）；2.正确识别mRNA，杂交；3.RCA滚环扩增形成滚动环扩增产物RCP；4.荧光探针的识别：5nt固定碱基＋2nt简并碱基＋2nt碱基（识别barcode）；5.原位测序解码RCP：通过重复测序探针的杂交和连接、成像和剥离，对每个测序周期应用相同的程序；6.荧光显微镜获取空间图像，使用CellProfiler定量产物的集成荧光强度。


dRNA-HybISS

1.准备固定后的样本切片；2.PLP探针共70nt：20 nt ID序列和20 nt通用锚序列；（一个基因有5个靶向位点，但barcode和anchor是相同的）3.识别mRNA， PLP探针杂交；4.RCA滚环扩增形成滚动环扩增产物RCP；5.Bridge探针共39nt ：17bp与RCP结合，2bp随机碱基，20bp与荧光探针结合；（一个基因有4种bridge探针代表4种荧光）6.荧光探针共20nt：每轮成像后，洗脱Bridge探针，重复添加；



Direct RNA targeted in situ sequencing for transcriptomic profiling in tissue. Sci Rep

10x Xenium

Xenium 技术通过对切片的原位核酸探针杂交，加上依赖 mRNA 的 DNA 连接反应，把 DNA 探针吸附到切片上目标 mRNA 所在的位置。通过对探针的滚环复制，增加可杂交的位点。再通过多轮的多色荧光标记寡核苷酸对样本进行杂交，用显微荧光扫描仪记录下每一轮的空间荧光信号。通过多轮的空间荧光信号的颜色信息，检测出目标 mRNA 在空间上的分布。人类乳腺癌panel（280个给定基因＋100个定制基因 ），小鼠大脑panel（248个给定基因＋100个定制基因 ）
1.将FF或FFPE组织切片转移至Xenium载玻片上（12mm×24mm的成像区域）；2.切片预处理，用可环化的DNA探针标记mRNA进行杂交，洗脱掉未结合的探针，进行滚环扩增；3.使用特定的携带荧光的探针对滚环复制后的target进行多轮检测；4.对多轮检测后的荧光信号进行分析，还原目的基因的信息。


原位捕获

原位捕获转录物，然后进行异位测序；放大信号：结合二代测序


Slide-seq

代替在玻片上打印区域条形码RT引物，人们可以将它们附着在溶液中的珠子上，然后将它们分配到玻璃表面。这一方法是由Slide-seq技术的研究团队在2019年采用的。与其他原位方法相比，组织图像是从相邻切片获得的，而不是从相同的切片获得RNA数据。
1.在涂有橡胶的玻璃盖玻片表面填充一层10 μm的特异性条形码微珠；2.通过SOLiD测序读取每个珠子上的不同条形码，形成空间索引；3.将FF组织切片转移至盖玻片上，反转录，组织消化；4.RNA文库构建，测序，基因表达定量，映射回原始空间坐标。


HDST

在Slide-seq方法发表后不久，另一种使用更小的条形码珠子的技术发布，命名为高分辨率空间转录组技术（HDST）。
探针杂交，成本高.捕获效率低 1.3%,提高了空间分辨率，同时可检测多达上万重的基因表达
工作流程：1.将FF组织切片转移至硅片（芯片上布满了六边形分割池，池中有带有oligo）；2.通过split的方法生成了2，839，865 个单独的条形码磁珠；3.结合14（4+5+5）轮荧光指导的探针杂交，获得了每个HDST 条形码独立空间坐标；4.对切片进行染色成像后，捕获RNA，将oligo从芯片上洗脱下来；5.RNA文库构建，测序，基因表达定量，空间信息对照。


ST/10× Visium

2016年发表的空间转录组学（ST）技术可以得到空间分辨的全转录组信息。2018年底，ST技术被10X Genomics公司收购并进一步开发，命名为 "10X Visium"。"10X Visium检测法在分辨率（直径55µm，条形码区域之间的距离更小）以及运行时间上都有改进。
1.新鲜冷冻样本的组织包埋和切片，固定在捕获区；2.固定，H&E染色，接着进行亮视野成像3.组织透化，从细胞中释放mRNA ， mRNA与spot上的空间条形码结合4. 反转录，cDNA合成；5.带有barcode的cDNA收集起来用于建库；6.数据处理、数据可视化和分析。


Stereo-seq

Stereo-seq通过时空捕获芯片，结合原位RNA捕获，实现了500nm的分辨率，同时捕获面积可达13cm×13cm，成为全球首个同时实现“纳米级分辨率”和“厘米级全景视场”的技术，且实现了基因与影像同时分析。
1.将含有随机条形码序列的DNB沉积到的芯片上；2.对阵列进行显微照相，用引物孵育并测序，以获得包含每个DNB的坐标编码（CID）的数据矩阵；3.通过与CID杂交，在每个点上连接分子编码（MID）和含有寡核苷酸的polyT序列；4.组织polyA尾RNA的捕获，通过将新鲜氮气冷冻组织切片加载到芯片表面，然后进行固定、渗透，最后进行逆转录和扩增；5.收集扩增后的cDNA，作为制备文库的模板，与CID一起进行测序；6.对测序数据进行计算分析；


DSP
Nanostring GeoMx Digital Spatial Profifiler的差异化在于它能够应用于FFPE样品。该仪器还具有空间剖析蛋白质的能力，尽管不是在同一组织切片上。它以迭代的方式工作，用户通过不同大小的显微镜（直径10-600 µm）手动选择感兴趣的区域（ROI）。
1.组织切片；2.成像试剂(荧光标记的抗体 & RNA探针 (辅助ROI选择))和样品杂交；3.根据荧光染色图像挑选感兴趣区域ROI；4.UV照射圈选的ROI，释放标签；5.ROI区域内的标签收集，将ROI的标签转移至相应的96孔板的孔中；6.采用nCounter进行技术定量；或者构建NGS文库，测序定量；


参考资料
原位检测技术 - 实验方法 - 丁香通 (biomart.cn)
学术爆款“空间转录组技术”，都有哪些技术？ | 空间转录组学方法综述 - 知乎 (zhihu.com)
【陈巍学基因】Xenium 组织原位分析技术_腾讯新闻 (qq.com)

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/644135392