使用MALDI-TOF技术诊断微生物感染

临床医师

虽然质谱分析法已经应用在临床检验医学中的各个方面，但是其对临床微生物学的影响无可争辩地超过其它学科。使用小量样本快速鉴定菌种进而降低成本，是MALDI-TOF质谱分析法为临床微生物学带来的一次根本性的转变。综观全球，MALDI-TOF MS技术的应用程度在各地区明显不同。MALDI技术在加拿大、澳大利亚和大部分欧洲国家中已常规地应用于临床微生物学，但美国FDA尚未批准在临床上使用。2013年10月美国《临床化学》杂志“Q&A”栏目在全球范围内邀请了四位在微生物实验室应用MALDI-TOF MS技术并拥有第一手经验的专家，深入探讨此项技术的应用界限，适用范围，以及未来的发展方向。《临床实验室》本期主题为“质谱与微生物”，通过整理这些专家的观点，希望能对读者提供当前应用MALDI-TOF MS技术所存在的不同意见。

    问题一：MALDI-TOF MS技术在临床微生物传染病的诊断应用过程中被吹捧为一场革命。但是没有一项技术是完美的。请问MALDI-TOF MS技术的最大优点和局限是什么？
    Gilbert Greub（瑞士洛桑大学医院微生物研究所医学微生物诊断室主任）：当其用于鉴定细菌菌株和真菌时，MALDI-TOF MS技术的主要优点是快速（＜10分钟）、试剂和技师（从操作时间来说）的低成本[＜2欧元（＜2.8美元）/鉴定]，并且在种属的鉴定上准确性＞95%。此项技术最主要的局限性是分析灵敏度相对较低（大约105-106细菌/每孔），但对在琼脂或血培养基中生长的菌落进行鉴定时，其准确性升高，因为这里经过了扩增步骤。因此，MALDI-TOF MS技术目前尚不适用于检测生理状态下无菌样本中潜存的小量细菌，如脑脊液。
    Susan Poutanen（加拿大多伦多西奈山医院微生物学家和传染病医师，多伦多大学检验医学／病理学和医学系副教授）：MALDITOFMS技术的最大优点包括：
    （1）快速鉴定标准培养基中的细菌和酵母菌；
    （2）与传统鉴定方法相比，降低使用成本和劳动负荷；
    （3）MALDI-TOF MS可与实验室自动化系统有机结合；
    （4）完善早期微生物鉴定的实验室工作流程；
    （5）具有早期微生物鉴定能力，从而提升病人照护并完善抗菌治疗方案；
    （6）此项技术的未来潜力，可应用于鉴定丝状真菌、确认耐药机制（如碳青霉烯酶产物）、辅助流行病学分型。
MALDI-TOF MS技术的最大局限包括：
    （1）先期购买MALDI-TOF MS设备的投入；
    （2）缺乏相对应的高速感受度报告系统，从而导致微生物鉴定报告和相关药物感受度报告之间的严重脱节；
    （3）此项技术有可能导致技术人员失去使用传统鉴定方法鉴定微生物的技能，从而在不使用MALDI-TOF MS技术时产生鉴定误差。
    Jens J?rgen Christensen（丹麦Slagelse医院临床微生物学系兼职副教授）：除了快速、低成本、操作简单以外，MALDI-TOF MS技术的最主要优点是通过计分算法进行最大可能性鉴定。如果系统无法提供确切的鉴定结果，它将不会给出任何提示，而会显示低计分值并提出警告，以此将谬误鉴定结果的可能性降到最低。局限性是，虽然在鉴定不同种属的菌株时该设备非常强大，但对于近缘种属，如肺炎链球菌、轻链球菌和口腔链球菌则难以区分。菌株制备（萃取、扩增），数据库种属容量和产生共识质谱的技术方法，优点和局限并存，需进一步标准化和最优化。
    Markus Kostrzew（德国不莱梅Bruker Daltonik GmbH公司临床质谱分析法研发中心副总裁）：MALDI-TOF MS技术的最大优势是其准确性和速度，使病人得到迅速并正确的治疗。目前，其主要的局限，是对鉴别先期未经培养的菌株和区分进化上非常接近微生物种属（如志贺氏杆菌/大肠埃希菌）的应用上非常有限。
   

    问题二：在临床微生物实验室中应用MALDI-TOF MS技术的主要考量（例如，技术和效益）是什么？什么原因导致临床实验室对使用MALDI-TOF犹豫不决？
     Gilbert Greub：当使用一种新工具时，最重要的是要考虑这种技术的优点和局限性，具体讲：
    （1）什么时候使用；
    （2）如何使用；
    （3）如何解读结果；
    （4）如何保证结果的溯源性；
    （5）所需的质控和维护。之于临床微生物学，MALDI-TOF MS技术可鉴定任何具有临床意义的菌株（琼脂上生长的分离菌落或阳性血培养）。纵然准确性很高，但解读MALDI-TOF MS检测的结果才是关键。对结果的解读很大程度上受到数据库内容和质量以及鉴定算法的影响。溯源性可通过使用自动菌落拣选系统和MALDI-TOF MS检测结果自动传输至实验室信息系统进行改善。考虑到MALDI-TOF MS设备的成本[大约20万欧元（28万美元）]以及维护费用[大约2万欧元（2.8万美元）／年]，临床微生物实验室如果每年的鉴定例数＜5000个菌株，则应选择其他成本更加划算的鉴定方法。另一个需要考虑的因素是在常规微生物诊断实验室中应用MALDI-TOF MS技术时，需实施必要的质控，包括阴性和阳性质控、及校准质控。未来需要考虑室内和室间质控。
     Susan Poutanen：在临床实验室中使用MALDI-TOF MS技术需考虑以下几点：
    （1）数据库的涵盖范围和准确性，以及实验室对其进行验证的能力；
    （2）设备的吞吐量；
    （3）设备操作是否简便；
    （4）设备的机械可靠性；
    （5）结果可否与实验室信息系统兼容；
    （6）应用MALDI-TOF MS技术的最佳方式是使整个实验室工作效率最大化；
    （7）设备的成本；
    （8）实验室所能实施的标准鉴定的数量和收回投资成本的时间；
    （9）MALDI-TOF MS鉴定结果的最佳报告方式，以避免由于报告新物种而带来的混沌。举例，尽管MALDI-TOF MS可进行种属级别的鉴定报告，但在有可能涉及已具有传统种属级别名称的微生物鉴定报告时（如凝固酶阴性葡萄球菌、草绿色链球菌、咽峡炎链球菌），要咨询该领域中的专家，并沿用原有的种属级别报告惯例。
    目前仍有一些实验室没有使用MALDI-TOF MS。特别对于标本量较小的实验室，它们需要权重MALDI-TOF MS技术的优点和局限，并意识到与较大实验室相比他们需要更长的时间收回MALDI-TOF MS设备的投资成本。对于这些实验室来说，他们需要耐心地等待MALDI-TOFMS设备成本降低，这也是未来的发展期望。
    Jens J?rgen Christensen：假设适当的验证程序，经济考量和实验室工作流程都得以认真细致的考察，并实施了成本—效益分析。MALDI-TOF MS数据传输至临床医生的送达过程非常重要。MALDITOF MS数据与菌群其他主要特征的相互整合也很重要。与临床医生之间的有效沟通是每个人都要重视的，在提交新种属鉴定报告时，必须要同时考虑到与其相关的临床价值。此外，实验室也应有处理不常见种属鉴定时的预案。
    Markus Kostrzew：我觉得无须犹豫，但是实验室必须规划好此项技术如何跟常规实验室的工作流程整合。与现有的实验室信息系统进行整合是必要的。
   

    问题三：MALDI-TOF MS的应用对临床微生物实验室最重要的贡献是什么？
    Gilbert Greub：在过去的三年中，我们常规应用MALDI-TOF MS技术鉴定阳性血培养沉淀中的菌种。此应用对临床管理产生了重要影响，并彰显MALDI-TOF MS技术对临床微生物学的贡献。事实上，细菌鉴定可指导抗菌治疗（可使革兰氏阴性菌的经验性抗生素疗法的适用性提高30%），从而对生存率和死亡率产生影响。应用MALDITOF MS技术鉴定琼脂板上菌落的速度要明显快于市场上以VITEK为代表的表型诊断系统。
    Susan Poutanen：考虑到许多临床微生物实验室将面对不断增长的工作负荷、而工作人员和医保经费递次减少的局面，MALDI-TOF MS技术的成本效率及其潜在的与实验室自动化相整合的特点，此项技术会对临床实验室产生有意义的贡献。
    Jens J?rgen Christensen：MALDI-TOF MS技术的贡献表现在三方面。第一，可快速鉴定培养皿上的菌株并直接鉴定阳性血培养样本，由此为临床提供指导，并提供用传统鉴定方法不能达到的２４小时内选择优化抗生素治疗的方案。直接鉴定病原体对严重侵入性感染的初期治疗非常重要。第二，在鉴定难养菌方面，MALDI-TOF MS技术只需小量样本（经典量是部分菌落），因此无需多次接种扩增。第三，抗生素药敏实验和耐药检测也是在其适用范围之内，可提供诸如甲氧西林敏感性或碳青霉烯酶产物的信息。但此一适用需要进一步的研究并标准化。
    Markus Kostrzew：MALDI-TOF MS技术在临床微生物实验室中的应用，可替代部分分离种群的检测工作，从而降低工作人员的工作负荷。在短时间内得出结果并迅速提交微生物鉴定报告是许多临床医生所欢迎的。
   

    问题四：当临床微生物实验室装备MALDI-TOF MS设备时，检验技师会有多种选择，而每种设备都有其自己的检测算法。是否有必要建立一个统一的微生物数据库和运算法则用于菌种鉴定？这有意义的吗？
    Gilbert Greub：如果有一个统一的微生物数据库是非常有利的。但是，最重要的问题是使用者对一些特征鲜明的菌株和种属通过开放的网络数据库普通源代码对设备数据库菌种容量进行扩增。这种操作必须加以控制并给以确认，以避免由于一些不良添加所导致错误鉴定结果。统一的运算法则不是必须的；相反，不同运算法则的选择对终端用户更有意义，因为一些运算法则适合某种鉴定，如金黄色酿脓葡萄球菌分型或链球菌菌株间的鉴别鉴定；而另外一些运算法则则适用于种属水平的鉴定，如棒状杆菌。
    Susan Poutanen：鉴于MALDI-TOF MS设备制造商之间的竞争，我看不到设备本身或微生物数据库统一的可能性，至少近期不会实现。假设任何一台MALDI-TOF MS设备使用统一的方法鉴定同一种微生物，从这个角度来讲统一是非常有利的，这样，同是使用MALDITOF MS设备检测得出的病人结果间则具有可比性，当然，这也会有问题。使用多样化的设备具有对误差的缓冲作用，从而减少了因为使用单一MALDI-TOF MS设备所带来的潜在系统性误差。例如，在一种品牌的MALDI-TOF MS设备中出现对特定微生物鉴定的系统误差，如果全部实验室都使用此系统，则所有的实验室的报告结果就都存在这种误差。但是，多种MALDI-TOF MS设备/数据库的使用使得报告这种误差结果的实验室数量减少。此外，如果只使用一种MALDITOF MS设备/数据库，实验室监测到这种系统误差将需要很长的时间，因为他们会从其他实验室报告相同误差的结果来确认他们自己的结果，因此要过段时间才能发现这一系统误差。
    Jens J?rgen Christensen：数据库和运算法则的发展很大程度上由企业启动。运算法则的多样化有助于识别漏洞。另一方面，这也使问题复杂化。分类学发展迅速。整合了所有微生物信息的“多相分类学”的出现，促使MALDI-TOF MS数据库向此靠拢。因此，运算法则应尽量客观地符合未来细菌种系的面貌。未来一定会是现存与新运算法则的融合。无论这些发展是由制造商还是科学团体推动，未来会给出答案。融合是必需的。
    Markus Kostrzew：不同设备供应商之间实现统一是不现实的。不同设备不仅运算法则不同，谱系的表型也不相同，这些都是公司的独有专利。谱系原是任何进一步分析的基础，从这些谱系中提取信息（如峰值列表）是质谱分析最关键的步骤。
   

    问题五：你们在多大程度上相信MALDI-TOF MS技术将用于微生物实验室？你们认为它会与现有鉴定方法竞争，甚至取而代之吗？
    Gilbert Greub：我们实验室从2009年便使用MALDI-TOF MS技术，进行常规鉴定分离菌株的检测，大约每周400例。这与VITEK卡式检测大量减少相关，目前只有5%—10%的分离菌株使用VITEK进行鉴定，这部分病例或者是MALDI-TOF MS菜单中不具备的鉴定项目或者是实际鉴定不能的（结果低值或对一些独特分离菌株的漏鉴定）。同样的，对16S rRNA　PCR和测序（以前用于以非常规方法对某些特选菌株进行鉴定）的需求量随着我们实验室引入MALDI-TOF MS技术而降低一半。因此，MALDI-TOF MS技术大大降低了其他鉴定实验的需求。然而，尽管MALDI-TOF MS技术的高准确性和低成本，临床微生物学家仍使用一些快速、低廉的表型检测手段（如过氧化氢酶或吲哚检测）作为首选的鉴定方法，或用于确认MALDI-TOF MS技术的鉴定结果。
    除此之外，在MALDI-TOF MS技术的其他应用（如分型和碳青霉烯酶检测）中，质谱分析法是更便宜、更快速的一线检测方法。但是，MALDI-TOF MS并不能完全取代现在的方法，因为MALDI-TOF MS技术在一些应用中存有显著的局限性。
    Susan Poutanen：是的，我相信MALDI-TOF MS技术将用于微生物实验室，并相信它的竞争性，甚至有可能取代传统的检测方法，至少在微生物实验室中的某些领域。事实上，这些现象已经发生在一些实验室中。虽然一些小型实验室当下还没有充分论证是否购买MALDI-TOF MS，一旦需求增加同时价格下降，我以为即使不是大多数也会是众多实验室将在一定程度上使用该技术。
    Jens J?rgen Christensen：MALDI-TOF MS技术具有潜力来取代和/或补充临床微生物实验室中对大多数菌株的常规表型鉴定的要求。它最大的优点在于直接从样本中寻找细菌并最终确认抗生素药敏试验，这些确立了该技术的核心位置。
    Markus Kostrzew：MALDI-TOF MS技术在许多实验室中已经取代生化检测。许多实验室使用该项鉴定技术，部分视为首选的鉴定系统。MALDI-TOF MS技术和分子生物学试剂相结合会在未来取代大多数的生化检测。
   

   问题六：使用MALDI-TOF MS技术进行微生物诊断时，应使用什么样的策略进行质量控制和标准化？
    Gilbert Greub：当然，每次测试都要施以阴性和阳性质控对照。阴性质控用来监控由于滴液、电荷转化或残留蛋白质所导致的假阳性结果比率。事实上，尽管按照实验要求用三幅醋酸盐彻底清洗MALDI微板，仍有大约0.1%的靶板点带有残留蛋白，这些残留蛋白产生的质谱会错误地诊断为其他种属。除了阴性质控，阳性校准质控也应定期检测，至少每天一次。检查靶板上细菌数量的室内质控目前尚在研发中，未来需要使用。最后，允许不同诊断实验室结果之间具有可对比性的室间质控也要考虑使用。
    Susan Poutanen：如同对任何一项新的传统鉴定系统都需要进行验证一样，MALDI-TOF MS制造商所要求的验证项目必须首先完成。由美国微生物学协会于2009年9月出版，Susan E. Sharp编辑“临床微生物学指导”中第Cumitech 31A款《临床微生物实验室程序的验证和确认》是临床使用的最佳指南。不使用上述指南的实验室，则需要用可信的参考标准物进行校准，如16S rRNA序列。此后，为验证使用MALDI-TOF MS技术正确鉴定微生物的状态，应定期使用常规量化微生物和室间质控予以评估。
    Jens J?rgen Christensen：为保证报告的质量，质量保证的概念需用到MALDI-TOF MS技术中。这意味着不同分类实体的细菌须被检测并对报告结果进行评估。每一天，实验室必须确保提交至临床医生的报告是符合质量保证要求的。这需要不断培训，并可像已在许多实验室中实践了的，建立一“专家用户”小组，以随时解决问题并在需要时提供指导。此外，质量保证的检测需要着重注意提交给临床医生结果的报告过程。虽然，更新分类的建议或检测到新的分类实体非常刺激，但在报告时要小心谨慎，因为这种“宽松”的鉴定结果和报告可以产生很多混乱。
    Markus Kostrzew：只要制造商提出，实验室就要使用质量质控，而且在每一次鉴定中都要使用。作为一种常规方式，还要使用额外的质控来检查整体性能。靶板点的清洗可以非常容易地由阴性质控来控制（只限于基质点）。
   

    问题七：如何对比MALDI-TOF MS技术与现有检测在微生物学中的使用（如经济性、操作简便、培训层次、易于理解、效率）？
    Gilbert Greub：与大部分其他鉴定方法相比，MALDI-TOF MS技术的细菌鉴定性能只会更好。虽然设备价格和定期维护费用相对较高，但MALDI-TOF MS技术在微生物学中的应用具有经济竞争优势，比诸如VITEK卡和PCR/测序等方法更便宜，因为质谱分析法的试剂成本低廉、技师的操作时间缩短。不仅如此，此项技术在实验室中易于应用，操作相对简洁，大多数结果易于解读。MALDI-TOF MS结果的解读非常重要，同时，微生物学家至少应根据以下几点来检查鉴定结果与细菌种属本身是否一致：
    （1）生长特性（空气或基质）
    （2）菌落形态
    （3）菌落的革兰氏阴性或阳性本质（如果存在）。
    结果解读还应包括某细菌种属存在于某样本中的合理性，以及结果中最佳匹配和第二匹配之间的数值差异。对数据库内容和运算法则的掌握可提升对结果的理解。
    Susan Poutanen：与传统实验相比，使用MALDI-TOF MS技术更合算、更简便、时间更短、结果易于解读，时间效率与工作效率更高。总体而言，该项技术至少在某些方面会取代目前实验室中应用的常规鉴定系统中的传统实验。
    但是，这并不意味着传统实验就无所作为了。考虑到现有的设备和数据库的状况，用MALDI-TOF MS技术对一些微生物进行鉴定也是困难重重。如果已被验证的设备出现问题，或作为问题已在文献中提出，那么传统检测仍需继续与MALDI-TOF MS技术共同使用，以辅助鉴别MALDI-TOF MS技术潜在的错误鉴定。
    此外，在实验室工作流程中的某些领域，一些简洁的鉴定方法（如尿液工作台）分析起来更有效，而不是所有的鉴定工作都要用MALDI-TOF MS技术进行。
    最后，为防万一MALDI-TOF MS设备发生故障，一些实验室仍决定将这些传统鉴定实验作为后备系统而使用（假设购买第二台MALDITOF MS设备是一个备用方案）。
    Jens J?rgen Christensen：菌株检查成本相对较低［约为1欧元（1.8美元）／鉴定］让MALDI-TOF MS技术比现有鉴定方法更具竞争性。但是，激光稳定性很重要，因为更换成本非常昂贵。对于常规临床微生物实验室来说，易于使用的技术是技师所期盼的。需花一些时间在操作培训、结果解读、结果报告上。不能低估培训和再培训的作用。
    Markus Kostrzew：MALDI-TOF MS技术操作简单。不过，因为此项技术与传统微生物实验室方法不同，需进行完全的培训。一旦应用，该项技术处理大部分病例的鉴定结果易如反掌。以前，此项技术的正性经济形象是能够在欧洲实验室快速普及该技术的主要因素。即使实验室每天的鉴定量在40-50个，其成本也在降低。
   

    问题八：目前，MALDI-TOF MS尚不能直接从血液中鉴定微生物感染，因此需要先期细菌培养。同样的，MALDI-TOF MS在诊断多重感染中存在局限。MALDI-TOF MS最终能应用在这些领域中吗？如果能，哪些步骤是必须的？如果不能，为什么？
    Gilbert Greub：至今，大部分实验室将MALDI-TOF MS技术用于对阳性血培养沉淀物的鉴定。MALDI-TOF MS技术的分析敏感性妨碍其直接用于少菌的临床样本，如血液。为节省从血液样本到阳性血培养的时间，最理想的是应用其他快速扩增步骤或进一步提高设备的分析敏感度。目前的运算法则不能稳定地鉴定多种微生物血流感染。但是，随着鉴定运算法则的改进（如减去瞬时达到的最佳峰值），鉴定出多重感染中的多种细菌的能力也会随之发展。鉴定运算法则不仅要考虑出现/未出现的峰值，同时要考虑峰值强度，这样才能明显增加MALDI-TOF MS的识别能力。
    Susan Poutanen：有些数据显示，至少对一些在纯培养基可显著增长的样本，MALDI-TOF MS技术已可以对无须先期培养基培养的尿液标本直接进行检测。无需事前培养已经可行，这使得尿液样本和其他样本直接使用MALDI-TOF MS技术进行鉴定有望实现。为使其成为现实，需要做更多的工作来确定什么样的标本类型需要怎样的前处理去除白细胞或其他物质以避免产生干扰蛋白质表达谱。还需要做其他的工作来改善MALDI-TOF MS技术的分析敏感度以适用于对数量较少或混合种属微生物的鉴定工作。如果这些直接检测样本的策略失败，可采用缩短富含营养成分标本孵育时间的另一种策略（初步研究的数据支持此策略）。
    Jens J?rgen Christensen：MALDI-TOF MS技术主要用于对培养的细菌进行鉴定。但直接分析某种临床样本也可得出满意结果。一些包括不同分类群的前瞻性研究表明，60%-80%的血培养阳性的单一微生物可以得到正确的直接鉴定，几达种属级别。目前已经可以直接检测尿液样本。虽然目前数据有限，但识别多重微生物感染接近可能。样本制备、基质成分和分析软件等方面的研发将推动上述几个方面的未来发展。
    Markus Kostrzew：直接鉴定血液样本并不现实，因为在没有扩增的情形下MALDI-TOF MS技术的检测阈值可能太高。而其他样本，如脑脊髓液，在样本制备和检测分析敏感性改善的前提下，可直接鉴定病原体。针对多重微生物感染，首个运算法则已经推出。如果需要可进行进一步的验证和修改。因为抑制效应会使特征信号消失的原因，可分析的混合物复杂度具有数量限制，最有可能的是不超过三种微生物。同时，混合物中任何一种微生物的相对含量会限制其检出，如混合物中一种物质的最低含量为10%。
问题九：还有其他建议吗？
    Gilbert Greub：未来，某些毒素或其他毒性因子的检测可由质谱分析法检测。因为分子量相对较小（＜20000 Da），目前的MALDITOF MS设备还无法检测大部分毒素。
    Susan Poutanen：在MALDI-TOF MS技术作为一种新兴技术装备微生物实验室时，PCR-电喷雾离子化/质谱分析法也以新兴技术的姿态进入人们的眼帘。虽然每种技术各有优劣，但不能彼此排斥。随着自动化的引入，这些新兴技术将使临床微生物学进入令人激动的时代。在相对较短的时期内，这些新兴技术将引领传统微生物实验室的巨大改变。
    Jens Jrgen Christensen：一个有趣的方面是，使用质谱分析法进行基因序列的鉴定，是其目前基于蛋白质的鉴定的一种补充。此外，虽然我们将关注集中于对细菌的鉴定，但是对侵入性真菌感染的鉴定的研究正日益加强，不远的将来，我们可能会看到这些微生物鉴定项目出现在鉴定分类群列表中。同理，药敏试验是另一个潜在的项目。
    Markus Kostrzew：目前，MALDI-TOF MS技术主要用于临床微生物实验室的种属鉴定。最近的研究显示其可扩展至其他领域，如卫生筛查、毒性菌株检测、某些耐药性检测等。因此，MALDI-TOF MS将会成为微生物实验室的核心技术。