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[分享] CRISPR-cas9:最常用的基因编辑工具

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发表于 2024-11-4 20:25 | 显示全部楼层 |阅读模式

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CRISPR-cas9自面世以后,完全改变了基因编辑所需的门槛:大量的基于CRISPR-cas9 系统的实验方法和治疗方法被开发出来,强有力地促进了现代医疗和生物学研究的发展。
本文简单介绍一下 CRISPR-cas9的来源和原理,因为我也不是做这个的....如果有哪些错误请诸位大佬不吝赐教!
CRISPR:细菌的免疫长城
CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是细菌中成簇存在的具有规律间隔的短回文重复序列,是细获得性免疫抵抗病毒入侵的有效手段。
可是获得性免疫怎么会在原核生物中出现?它又没有复杂的免疫系统!
在噬菌体等病毒侵入细菌时,实际上就是把自己的基因整合进细菌的DNA中,让细菌大量生产自己的蛋白质外壳和基因,重新组装成更多的病毒,在细菌终于不堪重负死亡后大量释放并入侵其他细菌。
CRISPR通过非常巧妙的方法实现了对病毒的获得性免疫:


当一段外源基因进入细菌后,会与cas核酸酶相结合,形成一段带有外源基因特征序列的间隔区(spacer)并掺入到CRISPR基因座内。
这样就会形成含有spacer序列的CRISPR 基因序列,而各个spacer则用回文序列(图中三角形)相隔开,从而转录形成具有spacer的CRISPR RNA。
CRISPR RNA因为来源于外源基因,所以它可以和相同的外源基因进行互补配对,藉由crRNA的互补配对引导cas核酸酶破坏靶DNA序列,从而完成整个免疫反应。
因为新的外源基因的进入能够被CRISPR-cas系统不断捕获并掺入CRISPR基因座,从而对相同的基因进行破坏,因此CRISPR 属于一种获得性免疫。

CRISPR-cas:刀法决定一切
在CRISPR系统发挥作用的过程中,cas核酸酶是其中最关键的一环,目前对CRISPR系统的升级都围绕着cas酶来进行,不同的细菌中cas核酸酶的种类也不尽相同,它们最大的差别在于对目标序列切除时的准确程度。
cas 的全称是CRISPR associated protein,它是一种通过crRNA引导的DNA内切酶,如果DNA底物与引导RNA互补,Cas9就会裂解入侵的外源DNA。


编码cas核酸酶的基因簇位于CRISPR序列的旁边,现在共发现了可分为35个家族的93种cas基因。目前根据使用的cas酶的不同可将CRISPR-cas系统分为两大类:


目前来说最常用的还是属于第二大类的CRISPR-cas9系统,cas9来自酿脓链球菌,也有实验室在做cas12a和cas13d,谁是更准确的那一个目前还有争议。
而常用的酿脓链球菌cas9需要靶位点下游的一个5'-NGG-3'基序,这段基序被称为其实就是前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM),导致了其可靶向的位置数量受到了限制,所以也有很多研究者在寻找来自其它细菌的cas9酶,看看是否可以突破这种限制。

CRISPR-cas9:最常用的基因编辑工具
一般的CRISPR-cas9 系统包括一段人工合成的Guide RNA 和 cas9酶,人工设计的Guide RNA 代替了细菌中的crRNA,CRISPR-cas9中的Guide RNA包括两部分:Scaffold 连接至cas9,形成gRNA-cas9 复合物;而spacer中包含了与目标序列互补的rna序列,引导 cas9 复合物与目标基因片段相邻的PAM序列结合,发挥剪切作用。


CRISPR-cas9 的剪切目标可以是任何长度为20bp左右的DNA序列,但需要满足两个条件:   

  • 这段基因在基因组中独一无二
  • 目标基因和PAM相邻
cas9核酸酶有两个内切酶功能域:RuvC和HNH。cas9在与靶基因结合时发生构象变化,最终导致靶DNA (PAM序列上游3-4个核苷酸)内的双链断裂,这种双链的断裂可以通过细胞的非同源末端连接和同源末端连接进行修复,但在修复过程中,尤其是非同源末端连接可能会导致无关序列的连接或碱基的缺失。

参考:
Addgene: CRISPR Guide
CRISPR - Wikipedia
酿酒酵母-3 基因操作技术 (居然是B站上的图,我才知道原来B站有专业大佬)

原文地址:https://zhuanlan.zhihu.com/p/54902967
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