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[分享] 手把手教学——CRISPR-Cas9系统:sgRNA的设计及质粒构建

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发表于 2024-11-4 19:07 | 显示全部楼层 |阅读模式

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CRISPR-Cas9系统基本工作原理涵盖了一系列分子事件,从CRISPR序列适应外源DNA片段,通过转录和加工生成成熟的CRISPR RNA(crRNA)或合成单导RNA(sgRNA),到sgRNA与Cas9蛋白的复合形成。
该复合物通过sgRNA的spacer序列导引Cas9蛋白高度特异性地结合至目标DNA,触发Cas9的内切酶活性,引发目标DNA的双链断裂。
细胞察觉到断裂后,启动修复机制,包括非同源末端连接和同源重组,以实现基因组的精准编辑,为疾病治疗和基因研究提供了创新性工具。



一、sgRNA的设计原则
1、特异性:确保sgRNA是特异性的,以免在基因组中发生非特异性的编辑。避免选择与其他基因序列相似的区域,特别是避免在基因组中存在多个拷贝的区域。
2、GC含量均衡:sgRNA的GC含量应该在40-60%之间,以确保在实验条件下有适当的稳定性和杂交性。
3、避免多个剪切位点:选择只有一个目标剪切位点的sgRNA,以避免非预期的多基因编辑。
4、避免重复序列:避免选择在基因组中存在重复序列或高度相似序列的区域,以减少非特异性剪切的可能性。
5、避免RNA结构影响:确保sgRNA序列不包含稳定的二级结构,以提高在实验条件下的有效性。
6、避免选择在基因组上匹配到多个位点的sgRNA,可通过sgRNA设计软件筛选出移码突变率高且脱靶位点较少的sgRNA。
7、构建T7/U6启动子驱动sgRNA表达载体时,需注意sgRNA的5'碱基最好为G,或者人为添加一个G来提高其转录效率。
8、若要引发移码突变,必须将sgRNA设计在CDS区域,最好靠近编码蛋白的N端,最理想的位置是位于第一或第二外显子上,以生成无功能性蛋白。
9、当基因存在多个转录本时,最好将sgRNA设计在同源区域。

二、sgRNA的设计
1. NCBI获取基因信息,选择编辑区域
在NCBI主页Gene界面输入基因名称搜索对应的基因。此处以人类KAT7基因为例;



2、点击search后,滚动至“基因组区域、转录本和产物”区域,将能够观察到该基因具有多个转录本,其中竖立的绿色方框表示外显子,每个转录本所共有的方框即为同源区。随后,点击GenBank;



3、下载序列,用snapgene打开,即可查看每个同源区对应的具体碱基序列;



4. 滑动网页至mRNA和蛋白质(s)位置,点击以NM开头的链接即可进入相应转录本的序列,不同NM的条目则表示该基因存在不同的转录本;



5、点击,下载转录本序列,用snapgene打开;



6、snapgene打开全长序列,找到所有转录本的共外显子。竖立的方框是外显子,在敲除过程中,目标是最大程度地削减KAT7蛋白的表达,以确保转录本的各个亚型均无法表现,因此,应当有针对性地删除这些亚型共享的基因区域,且最佳选择是尽可能靠近CDS区的ATG起始密码子;



7、在转录本序列中查找共外显子序列,找到共外显子所对应的外显子在转录本上的位置,并做出特殊标记;



8、复制那段外显子的序列到sgRNA设计网站,http://crispor.tefor.net/(网站有很多);



9、输入上述已选中的同源区域的碱基序列,选择正确的物种和Cas9蛋白;



10、网站生成的sgRNA序列信息如下,包括sgRNA序列、PAM、此网站提供的特异性评分、切割效率评分、以及潜在的脱靶具体信息(建议sgRNA设计3-4条,利于高效完成);



11、设计好的引物送引物公司设计合成。
注意:sgRNA的设计严格按照设计原则进行,需考虑所有候选靶点的序列、位置、正负链、GC含量、潜在的脱靶位点。

三、sgRNA质粒的构建方法
1、酶切载体
LentiCRISPR-V2质粒有两个BsmBI酶切位点,通过使用BsmB内切酶I,我们能够打开所需的区域。酶切条件遵循内切酶说明书,随后进行胶切、回收并备用。

2、寡核苷酸链引物退火
体系:



退火参数:
37℃ 30 分钟,95℃ 5 分钟,然后以每分钟降低5℃的速度将温度降到25℃

3、连接
体系:一般室温放置20-30分钟(NEB的快速T4连接试剂盒)



4、质粒转化:
① 从-80℃存储的Stbl3感受态细胞中取出并解冻,将5-10µL连接产物轻柔吹混匀后加入感受态细胞,接着在冰上孵育30分钟;
② 冰上孵育后,将感受态细胞放入预调至42℃的水浴锅中进行90秒的热激,然后返回冰上孵育10分钟;
③ 加入500 μL预热至室温的LB培养基,将混合物置于37℃摇床中摇菌30分钟;
④ 以3000 r/min离心3分钟,弃掉上清,利用冷却至室温的玻璃棒涂布培养皿(AMP抗性),随后在37℃培养箱中过夜生长。
5、挑取单克隆,摇菌,菌落PCR。
6、对PCR生成物进行琼脂糖凝胶电泳,运用凝胶成像仪进行成像,并挑选阳性菌落将其送往测序公司进行测序鉴定。
7、基于测序结果挑选目标菌落进行扩大培养,提取质粒以备用于后续实验室实验。

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本文作者是&#34;小米&#34;同学,在获得授权后,实验老司机将本文发表于公众号。
文稿:小米
校对:煲仔饭
素材:Canva
参考资料:

原文地址:https://zhuanlan.zhihu.com/p/710175850
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