4、质粒转化:
① 从-80℃存储的Stbl3感受态细胞中取出并解冻,将5-10µL连接产物轻柔吹混匀后加入感受态细胞,接着在冰上孵育30分钟;
② 冰上孵育后,将感受态细胞放入预调至42℃的水浴锅中进行90秒的热激,然后返回冰上孵育10分钟;
③ 加入500 μL预热至室温的LB培养基,将混合物置于37℃摇床中摇菌30分钟;
④ 以3000 r/min离心3分钟,弃掉上清,利用冷却至室温的玻璃棒涂布培养皿(AMP抗性),随后在37℃培养箱中过夜生长。
5、挑取单克隆,摇菌,菌落PCR。
6、对PCR生成物进行琼脂糖凝胶电泳,运用凝胶成像仪进行成像,并挑选阳性菌落将其送往测序公司进行测序鉴定。
7、基于测序结果挑选目标菌落进行扩大培养,提取质粒以备用于后续实验室实验。