标记免疫分析的回顾与展望

千姿百态

21 世纪被称为“生命科学的世纪”，临床医学是生命科学的重要组成部分，临床检验医学是临床医学一个重要分支，已经在人类疾病的诊断、疗效评价和健康评估等方面发挥重要作用。临床检验医学是临床医学与实验室科学相结合的一门新兴学科，它应用现代化检测仪器和医学检验技术定性或定量分析人体各系统、体液、组织、细胞的结构与功能；观察体内免疫、临床生化及活性物质在各种生理病理条件下的变化，为了解疾病的病因、病理、发病机制及采取治疗和预防措施提供科学依据。
                                    天津市天津医院、《实用检验医师》第一主任兼执行主编  王学谦 教授
      引言                           
      标记免疫分析技术是临床检验医学核心技术之一，临床检验医学的发展主要得益于免疫标记分析技术的发展和完善。自20世纪中叶起，逐步建立了各种免疫标记分析技术，在原有高度特异性基础上，极大地提高了免疫分析的敏感性，拓宽免疫分析的应用范围。如今，标记免疫分析广泛应用于体内激素水平、药物浓度、肿瘤发生早期标志物、心肌梗死标志物等微量或超微量物质的检测，同时也应用于感染性疾病病原体的检测。
      1 历史回顾
      免疫分析（immunoassay）是指基于抗原与抗体特异性结合的定量或定性分析技术，此项技术的出现最早可追溯至十九世纪末，1896年，Widal建立著名的肥大试验（Widal test）并用于协助诊断伤寒，从而开创免疫分析在临床医学中应用的先河。随后，临床免疫学者相继建立沉淀反应，溶血反应和补体结合反应等，构建经典免疫分析理论。1959年美国学者R.Yalow 和S.Berson 创立了放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA），并首先用于糖尿病人血浆中胰岛素含量的测定。放射免疫分析将放射核素的高灵敏性与免疫分析的高特异性相融合的一种用于超微量物质定量分析的技术，此项技术的出现为20世纪临床免疫学检验的超微量物质分析开辟了一个崭新的领域。随后此项崭新的技术迅速渗透到医学科学的其它领域，放射免疫分析的物质也由激素扩展到几乎一切生物活性物质，充分证明了该技术的巨大推动力。放射免疫分析开创体液超微量物质定量分析的先河，促进内分泌学的快速发展。因放射免疫分析技术在生命学科的巨大贡献，R.Yalow 荣获1977年度诺贝尔生理医学奖。随后1968年Mile和Hale创立免疫放射分析法 ( immunoradiometric assay，IRMA )，并创立免疫固相吸附分离模式。1971年瑞典学者Peter Perlmann 和 Eva Engvall、荷兰学者Anton Schuurs 和Bauke Van Weeman建立酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immuno-sorbant immunoassay，ELISA）。与放射免疫分析相比，酶联免疫吸附试验以微孔板作为固相材料，即采用“板式”操作模式，适合批量标本的测定。需要指出，1975年Kohler和Milstein建立了用杂交瘤技术用于制备单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb），成功制备小鼠单克隆抗体，即第二代抗体。1980年单克隆抗体正式引入放射免疫分析和酶免疫分析中，为非竞争性标记免疫分析的发展提供了必要的条件。此外，单克隆抗体的应用大大的提高了标记免疫分析的特异性和准确性，并在一定的范围内提高分析方法的灵敏度和缩短了检测时间。此后，标记免疫分析进入快速发展时期并在临床实验室得到广泛应用。1978年Halman建立化学发光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）；1982年Meurman建立时间分辨荧光免疫分析法（time resolved fluoro-immunoassay，TR-FIA）；1990年Leland等建立电化学发光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）；1990年，Klee等合成了一种稳定的吖啶酯（acridinium ester，AE）衍生物，发展了吖啶酯标记化学发光免疫分析。与放射免疫分析和酶免疫分析相比，发光免疫不仅进一步提高分析方法的敏感度，无放射性污染，抗干扰能力强等优点外，发光免疫分析多数采用“纳米颗粒”作为固相载体，以及分析过程的智能化与自动化。纳米颗粒不仅能够提供较大面积供包被更多的抗体分子，可减少免疫分析的“钩状效应”和拓宽检测范围，同时也为简化试剂生产过程和分离洗涤过程。1991年Ekins建立抗体微点免疫分析（micro-point immunoassay）或称为微阵列免疫分析（micro-array immunoassay），此项技术为如今组织芯片技术的建立奠定基础。
      2 分析原理
     “标记免疫分析”顾名思义是基于标记（示踪）和免疫（抗原-抗体）的分析方法。所谓标记是用高灵敏度物质如放射性核素、荧光素等标记在抗原或抗体上，通过检测示踪物质即可实现对微量抗原或抗体的检测。所谓“免疫”指抗原-抗体的特异性结合，即抗原和相应抗体在一定条件下发生特异性结合的现象；由于二者之间的特异（互补）性关系，采用已知抗原可检测未知抗体，反之采用已知抗体可检测未知抗原。标记免疫分析集示踪技术的高敏感性和免疫分析的高特异性于一体，赋予其较高特异性和较高敏感性。
      需要指出的是无论采用何种标记物（示踪物），标记免疫分析原理相同，只是检测手段不同：放射免疫分析采用放射性核素作为标记物，通过γ计数器测定信号，而电化学发光免疫分析采用三联吡啶钌作为标记物，需要在电极表面发光并通过光检测仪测得光的强度。因此，无论何种标记免疫分析系统，就免疫分析原理而言，可分为夹心分析模式、间接分析模式、竞争分析模式以及捕获分析模式。
      2.1夹心分析模式  夹心（sandwich）分析模式分为双抗体夹心和双抗原夹心，前者适用测定大分子抗原（蛋白质），后者适用于测定自身抗体或病原体抗体。1988年 Krawajew首次提出双特异性单克隆抗体夹心-ELISA分析模式。天然抗原具备多种抗原决定基（或抗原表位），理论上能够制备针对不同抗原表位的单克隆抗体；选择两株同一抗原但特异性不同的单克隆抗体，一株作为捕获抗体并与固相载体进行连接，一株作为检测抗体并与示踪物质结合；如分析体系中存在待测抗原，待测抗原将分别被捕获抗体捕获并同时结合检测抗体，与固相材料表面形成双抗体夹心复合物。双抗体夹心模式所采用的双特异性单克隆抗体需要经实验选择，确保同一抗原分子的两个表位与特异性抗体的反应不会受到空间位阻效应的干扰。同时，双抗体夹心分析模式分为一步法和两步法，所谓一步法是待检抗原与检测抗体同时加入分析体系，所谓二步法是先加入待检抗原与捕获抗体反应，洗涤后再加入检测抗体；一步法能够节省时间，但容易出现“钩状效应”，同时要求两株单克隆抗体具有较高的匹配性。与双抗体夹心类似，人们同样建立双抗原夹心分析模式并率先应用于HIV抗体的测定。双抗原夹心检测抗体时，与经典间接分析测定抗体相比，具有较好的分析特异性，但同样会出现“钩状效应”。
      2.2 间接分析模式  间接（indirect）分析模式是检测病原体抗体和自身抗体的经典分析模式。分析原理是用已知抗原包被在固相材料表面，加入待检标本，如标本中存在待测抗体与固相表面抗原结合形成免疫复合物；经洗涤后再加上标记抗抗体（针对待检抗体同种型表位的抗体，如待检为人体血清标本，则可应用羊抗人-IgG或兔抗人-IgG作为标记抗体）。此种分析模式中第一步反应为待检抗体与已知抗原之间属于抗原-抗体特异性结合，而第二步反应属于免疫球蛋白同种型表位（位于恒定区）与相应抗体结合，并非“一对一”的结合，即羊抗人-IgG可与人群中所有个体的抗体（IgG）发生结合，并且与抗体所针对抗原表位（可变区）无关。因此，为减少非特性结合，待检标本一般需要百倍稀释才能取得较好结果。
      2.3 竞争分析模式  竞争（competition）分析模式为双抗原竞争限量抗体，分析原理是将已知特异性抗体包被在固相材料表面，并将已知抗原进行标记制备标记抗原。将标记抗原和待测抗原同时加入分析体系中并竞争性结合限量特异性抗体。此种分析模式主要适用于测定小分子抗原（如甾体激素、药物分子等）。在酶免疫分析中，由于小分子抗原需要标记辣根过氧化物酶，而甾体激素往往不存在合适基团与过氧化物酶直接结合，给抗原标记带来一定困难；同时，与小分子抗原相比，酶蛋白分子较大，小分子抗原标记酶蛋白后，将会影响小分子免疫活性，导致不公平竞争反应。基于上述原因酶免疫分析不适合采用双抗原竞争分析模式用于定量分析小分子抗原。
      2.4 捕获分析模式 捕获（capture）分析模式专门为测定针对病原体IgM类抗体而设计。特异性IgM类抗体出现在病原体感染早期，且消失很快；为此，特异性IgM类抗体常作为判断感染病程的重要指标。捕获分析模式以抗人IgM包被固相材料，加入待检标本时可捕获血清中IgM（特异的和非特异的）；其次，加入已知抗原，已知抗原只结合特异性IgM（如存在）形成免疫复合物；再次，加入示踪物质标记的特异性抗体，并与固相捕获的已知抗原形成待检特异性IgM类抗体-已知抗原-标记特异性抗体复合物。目前，捕获法多用于与优生优育相关的病毒抗体检测（如TOCH）。（未完待续）      注：笔者有幸参加了国家高技术研究计划（863计划）资助的部分均相免疫分析研究工作，特别是对均相免疫诊断试剂制备的工艺流程颇感兴趣，有更多的资讯和大家分享。”

      3 基本类型
      在标记免疫分析中，常用的示踪物质分为放射性和非放射性两大类别。放射性物质主要指放射性同位素；非放射性标记物又包括：酶蛋白、胶体金、吖啶酯、三联吡啶钌等等。应用不同的示踪物（或标记物），可以建立不同的分析系统，如放射标记免疫分析、酶标记免疫分析和发光标记免疫分析等等。由于放射性核素半衰期较短以及给环境造成放射性污染，同时吖啶脂、三联吡啶钌等发光剂的广泛使用，放射性标记免疫分析逐渐被酶免疫分析和发光免疫分析所取代。
      3.1 酶免疫分析 酶免疫分析（enzyme-immunoassay，EIA）是以酶蛋白作为标记物的非放射性免疫分析技术，是在放射标记免疫的基础上发展起来的三大经典标记技术（酶免、放免、荧光）之一。酶免疫分析分为均相酶免疫分析和非均相酶免疫分析，而酶联免疫吸附试验是最常用的非均相酶免疫分析。与放射标记免疫相比，酶免疫分析无放射性污染，酶标抗体（抗原）可稳定保存较长时间，如采用酶显色底物容易测定等众多优势。特别是酶免疫分析采用微孔板（96孔或384孔）作为固相材料，以96微孔板为单位同时温浴、洗涤，节省时间，非常适合批量样本的测定等等。此外，斑点酶免疫技术和酶免疫印迹技术等是以硝酸纤维膜为固相载体，可采用多种已知抗原以“线性”方式包被，同时检测多种待检抗体，广泛应用于抗核抗体谱和过敏原特异性IgE等领域。需要指出，酶作为标记物，酶活性受环境因素（温度、酸碱度等）影响；酶蛋白分子标记半抗原分子将影响半抗原分子的免疫活性；微孔板包被面积有限和固相化会降低抗体（或抗原）分子活性等等。尽管上述问题对酶免疫分析产生不利影响，但酶免疫分析因其技术操作简单、酶标仪的开放性、试剂的国产化、不需贵重仪器、适合批量操作等优良性能，致使酶免疫分析在医学检验领域仍有很大应用和发展空间。
      3.2 发光免疫分析 发光免疫分析（luminescence immunoassay，LIA）是以发光剂作为标记物。现有发光免疫分析包括（直接）化学发光免疫分析（吖啶酯作为标记物）、电化学发光免疫分析（三联吡啶钌作为标记物，三丙胺为供氢体）、酶促化学发光免疫分析（酶作为标记物，但采用发光底物）。此外，发光免疫分析还包括荧光标记免疫分析（时间分辨荧光免疫分析和荧光偏振免疫分析）。与经典标记免疫分析（放射免疫、酶免疫）相比，多数发光免疫分析采用纳米微球作为固相载体，确保包被足量捕获抗体（或抗原），同时又可加速免疫反应缩短检测时间；此外，发光免疫分析与全自动化分析仪相结合，自动化水平有很大提高，使之成为检验医学领域中的重要检测手段。
      3.3 胶体金免疫分析  金免疫分析（colloidal gold immunoassay）是以胶体金（colloidal gold）作为标记物，硝酸纤维素膜为固相载体，结合抗原抗体反应建立的新型快速检测技术。胶体金最初只应用于免疫电镜技术，属于免疫组化技术；随后应用于体液物质分析，属于免疫分析技术。金免疫分析是以胶体金作为标记物，同时以硝酸纤维膜为固相载体，并借助层析或渗滤作用而建立的新型免疫分析技术，如斑点金免疫渗滤试验（dot immunogold filtration assay，DIGFA）和斑点金免疫层析试验（dot immunogold chromatographic assay，DICA）。DICA分析原理是将待检标本滴加在膜一端，受微孔滤膜的毛细管作用，向另一端慢慢移动，犹如层析一般，在移动过程中被分析物与固定于载体膜上某一区域的抗体（或抗原）结合而被捕获并富集，未结合物质（包括游离标记抗体）则越过此区域而被分离，最终通过胶体金的呈色条带来判定测定结果。金免疫分析技术以其简便、快速等优点被急诊医学、现场检查、家庭护理等领域应用广泛。

     4 分析性能评价
     任何事物均具有两面性，标记免疫分析显示良好的检测性能，同时也具有方法学本身局限性。
     4.1 技术优势
    （1）较高的特异性  标记免疫分析是利用抗原-抗体反应测定样品中待测物质的浓度，具有较高的特异性。标记免疫分析方法的特异性主要取决于抗体的特异性。因此，抗体质量的优劣对测定结果有很大的影响。应用单克隆抗体无疑可以提高其特异性，但也有它的局限性。应用不同单克隆抗体的检测系统之间，测定结果可能出现较大的差异，特别对测定不均质的物质（如TSH等）影响较大。
    （2）较高的灵敏度  标记免疫分析可以分析ng/ml-pg/ml水平，是一种高灵敏度的测定方法。如采用标记免疫分析测定浓度较高的物质，则需对标本进行稀释，这将带来很大的误差，所以也不适用。对于竞争性免疫分析，抗体亲合力是影响检测敏感度的重要因素，而在非竞争性免疫分析中，标记物的比活性（或标记率）是影响检测敏感度的重要因素。此外，如果以最小可测限作为灵敏度的标准，无论是竞争性分析还是非竞争性分析，对“0”点“试验性”或“操作性”的误差（R 0）也是影响分析灵敏度的重要因素。
    （3）良好的重复性和操作的简易性  由于标记免疫分析试剂和检测仪器（特别是全自动标记免疫分析仪）商品化的发展，使标记免疫分析的操作十分简便。特别是近年来自动化发光免疫分析仪的发展，商品化免疫试剂质量的进一步提高，重复性得到进一步提高。同时，这些优势是标记免疫分析得以广泛使用的重要因素。
      4.2 技术缺陷
    （1）分析物质的免疫活性而非生物活性  标记免疫分析所测定的是被测物质的免疫学活性，而不是物质的生物学活性。虽然在一般情况下被测物质的免疫活性与生物活性是相关的，但在某些生理或病理的情况下二者并不一定相关，对此应有充分的理解。
    （2）测定范围有限  标记免疫分析只适用于测定一定浓度范围的物质。抗原-抗体反应呈现比例性的特点，因此任何标记免疫分析方法只能在一定浓度范围内呈现良好的剂量-反应曲线，当待测物质含量超过检测范围，出现“钩状效应”并使检测结果降低甚至出现假阴性。
    （3）难于标准化 商品化试剂给标记免疫分析结果的标准化带来相当的困难，从而使标记免疫分析的结果带有明显的检测系统的异质性。任何一种天然抗原，可携带多种抗原表位，而单克隆抗体只识别单一抗原表位；换句话说，同一种抗原可制备多种单克隆抗体，如果不同检测系统采用不同单克隆抗体，由此会给检测结果带来较大影响。此外，标记免疫分析的干扰因素有的还未明确，反应基质对标记免疫分析的影响受到越来越多的重视。

      5 现状与展望
      近30年来，随着改革开放进程加快，国内临床检验医学的发展也驶入快车道，综合性三级甲等医院临床检验科已接近发达国家水平，进口高端分析仪器、进口免疫诊断试剂的广泛应用，提高了检验科服务于临床诊断水平，并创造可观的经济价值。同时，临床检验医学的发展促进免疫诊断试剂工业的诞生和快速发展。据2012年统计全球诊断试剂市场的购买力约为200亿美元，其中免疫诊断试剂约占30%，且年均增长率约为20%-30%。需要指出的是，由于全自动免疫分析仪均为封闭系统，既使分析原理相同，也不能使用仪器生产商以外供应商提供的试剂，显示试剂-仪器一体化的特点。由于国内免疫分析仪产业并未跟进，导致临床检验科大型免疫分析仪全部为进口设备。国内免疫分析仪器领域发展落后，产生的短板效应严重影响免疫诊断试剂领域的发展。近年来，随着我国经济实力不断增强，科技投入不断增加，国内免疫诊断试剂工业也在发生变化。国家科技部非常重视免疫诊断试剂领域的发展，在2010年度国家“863”生物和医药领域体外诊断技术产品开发重大项目指南中，“开放式全自动管式化学发光免疫检测系统研制”被列为首项。同时，各种全自动、半自动免疫分析仪器不断面世，与发达国家的差距正在缩小。可以确信免疫分析仪器的发展势必会促进免疫诊断试剂的发展，同时也会促进相关支撑学科基础理论和应用技术的快速发展。
      5.1 大型化与小型化分析仪器的均衡发展  如今三级甲等医院检验科的分析仪器已基本达到自动化和智能化水平，发光免疫分析已全部实现全程自动化，全自动酶联免疫分析仪也在临床实验室推广应用，甚至国内已开始引进全实验室自动化流水线。然而，我国是一个地域辽阔的国家、全国各地区经济发展水平极不平衡，导致临床医学资源过度集中在发达地区和中心城市，人们群众就医难、看病贵的局面很难得到缓解。因此，医学检验领域发展也应该结合中国实际，需要发展适合基层医院使用、临床急需的医学检验仪器和相关检验试剂。只有检验科水平提高，才能有效提高基层医院和社区医院诊断水平，真正缓解目前群众就医难的局面。
      5.2 标记免疫分析的室间控制不断完善  如何实施严格的质量控制是标记免疫分析的重要课题。通过严格的室内和室间的质量控制可以提高工作水平、改进实验方法、为临床提供准确可靠的结果。目前标记免疫分析已经有了比较完整的室内质量控制方法，重要的是在实际工作中认真的执行。在标记免疫分析的质量控制中，最重要的是室内质量控制，它是获得准确的实验结果和室间质量评价的基础。应该指出的是，目前由于商品化试剂盒未能实现完全标准化，所用抗体存在较大异质性，室间质量控制虽取得较大进步，但仍然存在较多问题。应用国际质控血清和开展实验室比对，有助于促进标记免疫分析的标准化，提高实验结果的准确性。
      5.3 免疫芯片不断完善与多项指标联合测定  针对肿瘤高危人群健康普查、自身免疫性疾病自杀抗体谱检测、过敏性疾病过敏原确认等等，临床需要多项指标的联合测定。基于抗原-抗体结合的免疫芯片是解决多项指标联合测定良好措施。免疫芯片( immunochip) 也称抗体芯片( antibody- chip)是实际应用中最重要、研究最多的一种蛋白芯片，是将抗原-抗体结合特异性结合与电子芯片高密度集成原理相结合而产生的新型免疫分析技术。免疫芯片基本原理是将几个、几十个, 甚至几万个或更高数量的抗原（或抗体）高密度排列在一起制成芯片,与患者待检样品或生物标本同时进行反应，可一次获得芯片中所有已知抗原（或抗体）的检测结果。免疫芯片根据载体不同，分为平板芯片（或固相芯片）和微球芯片（或液相芯片），液相芯片又称多项分析悬浮阵列，简称悬浮阵列。微球芯片是一种有发展前景的医学检验新技术并初步应用于临床实验室。微球芯片由美国luminex公司于1997年最早建立，是一种免疫芯片与流式细胞术相结合的新技术。技术的核心是在制备微小的乳胶颗粒时，分别将不同的荧光染料按照一定的配比，合成100~500种不同的荧光微球，并将不同的荧光微球予以各自唯一的编码，形成100~500个通量的检测。不同的荧光微球包被不同已知抗原，用于检测相应抗体。检测时把针对不同检测物的不同编码的荧光微球混合，再加入被检物，被检物与悬液中的混合荧光微球乳胶颗粒特异性地结合( 杂交反应仅需10min ) ，并通过随后加入荧光标记抗体进行待检抗体的测定。结束反应后，混合荧光微球乳胶颗粒被微量液体传送系统排成单列通过流式双激光检测系统，其中一束激光根据荧光微球颗粒的编码进行微球分类归位，从而决定被检物的特异性，即确定检测的靶物质; 另一束激光则通过检测某一编码的荧光微球上荧光信号的强弱，确定被检物是否存在，根据标准曲线从而给被检物定量。所有的得到的数据经计算机处理分析可以达到高通量检测的目的。
      5.4 均相免疫分析逐渐成熟  众所周知目前标记免疫分析以非均相免疫分析占绝对主流。所谓非均相免疫分析是指体系中存在游离状态标记物和结合状态标记物，首先需要分离并去除游离状态标记物，其次再测定结合状态标记物。固相吸附分离是非均相免疫分析的常用分离方法，“包被”和“洗涤”是两个重要环节，一般情况下“包被”过程由试剂生产商完成，“洗涤”过程由用户在测定过程中完成。然而，由于检测时需分离过程，不论检测时间、仪器的自动化、分析精密度等方面均受到很大影响。1993年Ulman创建一种新型的均相免疫分析技术，并经不断发展和完善已初步应用于医学检验领域。均相发光免疫分析系统有两个微球组成，利用作为供体和受体的微珠来检测生物分子的相互作用，微珠表面覆盖了一层水凝胶，作为生物连接的功能基因。当生物分子存在相互作用时，这种相互作用会将供体和受体微珠拉近，从而激发级联放大的化学反应，产生极大增强了信号。具体来说，在激光（波长680nm）的照射下，供体微珠上的光敏剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单体氧。单体氧扩散至受体微珠，与其上的化学发光剂反应，进一步激活了同样在受体上的荧光基因，使之发出荧光，波长为520~620nm。单体氧的半衰期为4μSes，在溶液中的扩散距离为200nm左右。如果生物分子不存在特异的相互作用，单体氧无法扩散到受体微珠，则不会有荧光信号产生。

      注：笔者有幸参加了国家高技术研究计划（863计划）资助的部分均相免疫分析研究工作，特别是对均相免疫诊断试剂制备的工艺流程颇感兴趣，有更多的资讯和大家分享。”