原位杂交四部曲之- 荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridiza-tion, FISH)

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1 背景知识介绍
荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridiza-tion, FISH)因具有灵敏度高、特异性强、定位明确及结果客观等优点。在临床上已应用于产前染色体数目检测、肿瘤基因检测,如多发性骨髓瘤检测和慢性淋巴细胞性白血病等的检测,担负着辅助病理诊断和指导临床用药的重任。总的来说，FISH在基因诊断、肿瘤遗传学、病毒感染分析等方面发挥了重要的作用提供了，有力的科研工具[1]。



（图片1 细胞内细菌感染FISH标记[2]）

2 FISH探针设计
FISH主要步骤包括：合成核酸探针、标记、纯化和特异性靶标退火（基本工作流程与印迹杂交近似），目前主要有两种办法来实现可视化显示原位RNA和DNA靶标。因为靶向的目标不同（RNA或DNA），在探针的设计遵循的基本虽然比较类似，但也存在差异。
2.1 FISH-RNA
FISH-RNA 研究目的定位RNA（靶基因）在细胞中空间位置的技术，这种定位的基本原理是依据基因的碱基互补配对原则（探针是单链的/寡核苷酸探针），结合探针的荧光基团标记去结合细胞中的靶标RNA，使用共聚焦显微观察荧光信号来确定目的 RNA 在细胞中的分布。转录模板应支持探针（反义链）和阴性对照（正义链）RNA 的转录。在制备探针之前，必须对环状模板进行线性化。FISH-RNA探针长约250–1500个碱基，长度为800 个碱基左右的探针具有最佳灵敏度和特异性[3]，也有说20-500个碱基[4]。然而，成功的FISH已经实现了更小的和更领命的探针，寡核苷酸探针的大小范围从20到50个碱基,为了出现假阳性务必增加阴性对照。
2.2 FISH-DNA
FISH-DNA探针为原位杂交对检测靶基因提供了可能。但是，FISH-DNA与RNA探针相比， DNA 探针与靶 mRNA 分子的杂交强度较弱，因此在杂交后的洗涤中不应使用甲醛，目前也是更多研究使用FISH-RNA探针的缘故[3]。此外，RNA探针因是寡核苷酸了（单链）、高分子结合力、可适应高温（55–62℃）杂交的特性，其检测特异性和灵敏度均优于DNA探针。在杂交过程中如果探针和靶基因超过5%的碱基对不互补，结果会导致探针和靶序列发生轻度杂交，这意味着可能无法正确检测，因为探针更容易杂交后的洗涤和检测步骤中被消除。因此，不论是针对FISH-DNA或FISH-RNA都应该确切的知道靶基的特异序列。
2.3 FISH探针的设计
目前精选FISH探针的设计的主要网站有两个，即LGC Biosearch Stellaris RNA FISH probe designer(https://www.biosearchtech.com/stellaris-designer)，和iFISH更多的用于FISH-DNA探针的设计（http://www.ifish4u.org/）。 iFISH网站能够快速获得针对人类所有基因座的FISH-DNA探针 [5-6]。在网站或第三方平台完成探针设计后，应该对探针特异性进行验证，例如自己靶基因的测序序列（这种情况是最准确的），当然对于一些不知道确切的序列的基因，可在NCBI上针对设计的探针进行逐条比对，若某一条探针靶向到非靶标区域，则进行排除。此外，探针的设计时候，应该多设计几条，例如研究人员在进行LINC00973的研究过程中设计了10条探针[7]。
2.4 探针应该标记染料
目前市面上常见的探针应该标记染料主要有5类：（1）荧光素类染料，荧光素类染料包括标准荧光素及其衍生物，常见的有异硫氰酸荧光素（FITC，常用的一种荧光素染料）、羟基荧光素（FAM）、四氯荧光素（TET）；（2）罗丹明类染料（Rhodamine dye），罗丹明类染料与荧光素类染料相比，他们具有更高的荧光产量更、更低的pH敏感性、强的光稳定性；（3）菁染料，他们也是使用比较广泛的探针标记探针染料，目前市面上菁标记染料主要有两类，一类是噻唑橙（thiazole orange, TO）、噁唑橙（oxazole orange, YO）系列及其二聚体染料，另一类是多甲川系列菁染料；（4）其它染料，二苯乙烯、萘酰亚胺、香豆素类、吖啶类、芘类等[8]。
3 FISH实践操作
3.1 材料处理
一般情况下实验取材主要是组织和细胞，不论什么样的样品在进行操作的时候应该尽可能保持DNA和RNA处于组织或细胞内水平。尤其是RNA，特别容易被RNA酶降解，应该在取样后立即进行固定处理。不同的样本固定的方式不一样，对于将用于石蜡包埋的组织切片使用4%的多聚甲醛（具体固定时间根据样品而定）；对于冷冻切片可使用4%的多聚甲醛或使用Bouin固定（一般是30min，具体时间根据样品而定）；对于涂片样本，一般使用甲醇/醋酸溶液固定（一般15min，具体时间根据样品而定）。
3.2 样品预处理
石蜡包埋：需要进行脱蜡和复水步骤（二甲苯：2x3 分钟（具体时间根据切片的脱蜡情况而定）；1:1 = 二甲苯：100% 乙醇：3 分钟；100% 乙醇：2x3 分钟；95% 乙醇：3 分钟；70% 乙醇：3 分钟；50% 乙醇：3 分钟；使用冰冷的自来水洗涤；抗原修复（使用20µg/mL蛋白酶 K的50mM Tris预热并在 37 ℃条件下孵育酶解 10–20 分，也可以精选高压或沸水浴进行修复））；细胞或冷冻切片（需要抗原修复），不需要这些步骤，直接进行下一步。
3.3 样品通透
对于FISH的样品通透，一帮使用20% (v/v) 乙酸（组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断，从而降低背景）中 20 秒（也可以调低浓度增加处理时间），这样可使细胞通透化，使探针或抗体能够透过。此外，也可以使用0.3% Triton X-100（去垢剂）进行通透，增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞。需要注意的是，过度的使用去垢剂会导致组织/细胞形态发生变化以及核酸丢失。
3.4 杂交液孵育样品
杂交缓冲液对样品进行孵育有助于阻断样品可能与探针产生非特异性结合的位点，从而达到减低背景的目的。对于杂交液，建议后买商品化的工作液或储液，然后根据说明进行杂交孵育。杂交液的配制是比较麻烦的，涉及多种样品，具体参考Abcam提供的杂交液配方[3]。
3.5 样品变性
必须明确一点，原位杂交过程中的核苷酸序列必须是单链（寡核苷酸链），因此对于DNA的检测需要进行变性。常用的变形办法是为碱变性和热变性，具体变性条件可根据预实验摸索。细胞样品DNA，潮湿环境中80℃进行变性，染色体DNA样品处理2min；组织样品DNA，变性条件可选择80℃ 10min，完成变性后放于冰面上，防止其重新退火。而RNA（或mRNA）不需要进行变形处理。
3.6 杂交
样品和杂交液进行预处理：（1）载玻片预处理：载玻片（含有杂交液）置于所需杂交温度下的潮湿杂交盒中孵育1小时，杂交温度的范围通常为40–62℃；（2）探针预处理，在PCR管中用杂交液稀释探针（注意避光），利用PCR仪在 95℃条件下加热2 分钟，使其变性，然后立即将探针置于冰上冷却，以防止重退火。
探针预靶基因杂交：载玻片杂交液去除，加上合适体积（50-100μL，0.5-5.0μg/mL，具体也可以根据生产商推荐的浓度）的探针工作液。然后在杂交温度（40–62℃）下进行杂，一般来说细胞的杂交在5min-2h，组织样品一般是数小时甚至过夜，因此杂交的温度，时间应该根据细胞，组织，基因表达情况进行优化。
杂交常用：杂交常用条件：50% 去离子甲酰胺、2x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 buffer; pH 7.0、1 mM EDTA、载体DNA/RNA (1 mg/ml)、探针(20 - 5000 ng/ml)、1x Denhardt’s、5 - 10%硫酸葡聚糖、+37 to +42°C下杂交5 min - 16 hours；
短链杂交短链：短链寡核苷酸探针，具有特殊的杂交动力学和杂交体稳定性，可尝试从以下杂交条件开始优化：25% 去离子甲酰胺、4x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 buffer; pH 7.0、1 mM EDTA、载体DNA/RNA (1 mg/ml)、探针(20 - 5000 ng/ml)、5x Denhardt’s、+15 to +25°C下杂交2 - 16 hours。
3.7 杂交后的洗涤
样品完成杂交以后，通过调节温度、盐浓度和洗涤剂浓度等溶液参数可消除非特异性相互作用进而降低背景，但过度的洗涤也会导致特异性结合消失。
SSC缓冲液配制：
表1 配制1L 20X柠檬酸钠缓冲液（SSC）


表2 洗涤剂1


洗涤剂3：0.1X-2X 柠檬酸钠缓冲液（SSC）
样品的洗涤：
（1）洗涤剂2：3x5 分钟，37-45 ℃；在较高温度（高达 65° C）下短时间洗涤，洗去多余的探针和杂交缓冲液。如果洗涤时间过长，则会洗掉大量的杂交探针 RNA/DNA。
（2）洗涤剂3：3x5 分钟，25-75 ℃，此步骤会消除非特异性和/或重复性 DNA/RNA 杂交。
3.8 显色与观察
3.8.1 探针分类
探针分类：在设计探针的时候，应该知晓探针具有直标型荧光探针和间标荧光型探针：（1）直标型荧光探针：DNA探针直接与荧光素基团共价连接，可以使用DAPI/PI复染色后可直接在荧光显微镜下采集数据；（2）间标型荧光探针则：DNA探针先与半抗原（生物素、地高辛）连接，然后半抗原再与荧光素基团连接从而形成探针－半抗原－荧光素基团复合物，具备更强的荧光信号，才能使用荧光显微镜进行数据采集。目前，随着技术的提升，直标型探针更广泛的应用与实践中，例如在疾病诊断领域，大多采用直标型设计。



（图2 直/间接型荧光探针，备注：间接型荧光探针具备更强的信号）

3.8.2 间标荧光型探针后续操作
在此我们以地高辛为例：
（1）使用MABT洗涤
MABT洗涤剂的性质比PBS更温和，更适用于核酸检测，在室温下使用 MABT（含 0.3% Tween 20 的马来酸缓冲液）洗涤两次，每次15分钟；
表3 10X MABT配制


（2）玻片干燥：室温干燥即可；
（3）样品封闭：将玻片使用封闭液（MABT + 2% BSA，或商品化封闭液）封闭，转移至潮湿的盒子在室温（25℃）封闭1-2h；
（4）添加抗体：根据抗体使用说明书，调节抗体的工作浓度，室温（25℃）孵育1-2h；
（5）样品洗涤：使用 MABT 洗涤载片 5 次，每次 10 分钟；
（6）显色与观察：显色系统包含常用的有两种：POD和底物DAB/咪唑；AP和底物BCIP/NBT。该显色系统检测灵敏度提高，成色后色原性物质的稳定性和定位功能更好，且显色可以永久保留。
4 注意事项
（1） 脱蜡不彻底：石蜡去除不完全，则会导致切片的染色效果较差。
（2）蛋白酶 K处理时间：蛋白酶 K 的最佳浓度和时间应该更具具体组织类型，固定时间和组织大小进行预实验来确定。若酶解不充分会导致杂交信号降低，过度酶解会影响组织形态，给杂交信号的定位带来极大困难。
（3）蛋白酶K不是万能：对于结缔组织，肝组织等样品，还可进行Collagenase和Dispase的组织消化处理，以降低背景[9]。
（4）组织洗涤：极短的 DNA/RNA 探针 (0.5–3 kb) 或极为复杂的探针，洗涤温度应更低（≤ 45 ℃）且严格度更弱的SSC (1–2x SSC)；对于单基因座或较大的探针，温度应在 ≈65℃且严格度应较强（低于 0.5x SSC）；对于重复性探针，温度应达到最高且严格度应达到最强（例如 α-卫星重复序列）。
5 结束。

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参考：
[1] Cui C, Shu W, Li P. Fluorescence In situ Hybridization: Cell-Based Genetic Diagnostic and Research Applications. Front Cell Dev Biol. 2016 Sep 5;4:89. doi: 10.3389/fcell.2016.00089. PMID: 27656642; PMCID: PMC5011256.
[2] Korotaev, A.; Benken, K.; Sabaneyeva, E. “Candidatus Mystax nordicus” Aggregates with Mitochondria of Its Host, the Ciliate Paramecium nephridiatum. Diversity 2020, 12, 251. https://doi.org/10.3390/d12060251
[3] https://www.abcam.cn/protocols/ish-in-situ-hybridization-protocol
[4]https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzU5MTIzMzQwOA==&mid=2247485984&idx=1&sn=7f25e952d5c7536ecb05a0fa4de2cc49&chksm=fe3362cfc944ebd9850d67824b67a7834e3c32149fbbf32363a07b319b9bdc05e23b94220fa0&token=1581546962&lang=zh_CN#rd
[5] https://zhuanlan.zhihu.com/p/64444935
[6] Gelali E, Girelli G, Matsumoto M, Wernersson E, Custodio J, Mota A, Schweitzer M, Ferenc K, Li X, Mirzazadeh R, Agostini F, Schell JP, Lanner F, Crosetto N, Bienko M. iFISH is a publically available resource enabling versatile DNA FISH to study genome architecture. Nat Commun. 2019 Apr 9;10(1):1636. doi: 10.1038/s41467-019-09616-w. PMID: 30967549; PMCID: PMC6456570.
[7] https://bio-protocol.org/pdf/Bio-protocol1010810.pdf
[8] https://www.abace-biology.com/fish-techniques.htm
[9] https://pro.biomart.cn/lab-web/news/article/31m308ago4qfv.html

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/707728410