答应我，看完再做ELISA（上）

风云

作为必备实验技能之一的ELISA已经成功逼疯了一大批研究生：加样加到手抽筋，拍板拍到人发疯。为此，小优呕心沥血写了一份ELISA实验详解，原理、步骤、注意事项一网打尽，帮助各位小伙伴快速入门并精通ELISA（分为上下两篇噢）。

ELISA实验原理
酶联免疫吸附试验 (Enzyme-linked Immunosorbent Assay，简称ELISA)， 是一种利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法，是免疫学经典实验方法。ELISA可适用多种样本类型，主要包括血清、血浆、细胞培养物上清液、细胞裂解物、唾液、组织裂解物和尿液等。

实验名称特点	WB	IHC/IF	ELISA
定性	√	√	√
定量	半定量	半定量	√
定位	√
灵敏度	中	中高	高
样本类型	组织细胞	组织细胞	血清血浆细胞培养上清体液……

表1 ELISA与常规免疫实验对比

ELISA实验类型
1.直接法ELISA：将抗原固定在微孔板上，使用酶标抗体孵育抗原，最后加入酶反应的底物进行显色反应，显色产生信号与所结合的分析物量成正比。
2.间接法ELISA：将抗原直接固定在微孔板上，首先将不带有标记的一抗加入微孔板，与板内抗原特异性结合，接着加入酶标二抗识别一抗，最后加入酶反应的底物进行显色，显色信号值与所结合的分析物量成正比。
3.夹心法ELISA：最常见的ELISA类型。两种特异性抗体将抗原夹在中间，通常称为配对的抗体对。将捕获抗体包被在微孔板上，加入样品后，捕获抗体与样本结合，然后再加入酶标记的检测抗体，形成夹心抗体对，最后加入酶反应的底物进行显色反应，显色产生信号值与所结合的分析物量成正比。夹心法ELISA使用两种抗体与抗原结合，因此特异性更高。
4.竞争法：将捕获抗体包被在微孔板上，加入标记的抗原，该抗原可与样本中的目标抗原竞争性结合捕获抗体，样品中存在的抗原越多，能够与捕获抗体结合的标记抗原就越少，加入底物并产生信号，信号值与样品中存在的蛋白量成反比。

ELISA类型	优点	缺点	适用场景
直接法ELISA	操作简单，实验耗时短	a) 仅使用一种抗体，所以特异性不够高b) 如果来自样本的所有蛋白质都被固定在孔中，则有可能出现高背景	评估抗体的亲和力和特异性及研究阻断/抑制相互作用
间接法ELISA	利用二抗进行信号放大	二抗可能引起交叉反应	测定内源性抗体
夹心法ELISA	a) 高特异性和高灵敏度b) 与复杂的样品基质兼容	a) 实验流程较长b) 配对抗体对的开发具有挑战性	确定生物样本中的分析物浓度
竞争法ELISA	能够定量小分子	a) 仅使用一种抗体，特异性不高b) 需要标记抗原	确定小分子和激素的浓度

表2 四种ELISA类型的比较

如何选择合适的ELISA试剂盒
小伙伴们在了解了ELISA的原理和类型之后，是不是迫不及待得要开始大展身手了，NO!最重要的ELISA试剂盒，我们还没好好选一选呢。俗话说，兵马未动，粮草先行，选择一个有质量有保障并且适合自己实验的ELISA试剂盒，才能够保证后续实验的顺利进行。ELISA试剂盒的选择和抗体的选择一样，我们都要考虑很多因素，包括以下方面：
1. 样本种属：一般情况，不同种属不能通用。小鼠、人或者其他家禽的因子检测要选择对应种属的试剂盒。
2. 待测因子表达水
3. 平：待测因子表达水平决定着我们要选择的试剂和检测限和灵敏度。
4. 样本类型：ELISA实验可以检测的样本类型包括：血清、血浆、细胞培养上清、尿液等，不同的试剂盒适配的样本类型不同。并且不同的样本，预处理也会有所不同。
5. 文献支持：相同的种属，指标、灵敏度，当然会选择发表高分文献多的那一个啦。
6. 试剂盒类型：ELISA的试剂盒有即用型和研发型两种，即用型里面包括实验所需的所有试剂，适合新手；研发型试剂盒需要自己包被微孔板，胜在经济实惠，适合ELISA已经做得炉火纯青的熟手。
7. 仪器设备：ELISA 检测方法有很多，但在实验室中最普遍的方法是比色、荧光和化学发光法，其中比色法又是最常见的，每个孔中的显色量用分光光度计读取，样品在彼此之间进行比较，或与用已知分析物浓度制成的标准曲线进行比较。也就是说，ELISA的实验结果需要用酶标仪在对应的波长下检测吸光度，一般也会使用双波长测定（检测波长和校正波长），所以酶标仪需要能够设置到我们使用的两个波长。
小优在这里也给大家推荐两个品牌的ELISA试剂盒，bio-techne旗下的R&D systems作为ELISA的金标准，一直致力于开发包括细胞因子、ELISA试剂盒、抗体、Luminex液相芯片、多因子检测固相芯片在内的免疫学和细胞生物学产品，可提供即用型和研发型两种ELISA试剂盒。Absin，中国人自己的生命科学百宝箱，也能够提供即用型的ELISA试剂盒，包含一整套完整的试剂，国产的价格，进口的品质。

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