ELISA实验步骤

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ELISA
一、包被抗原
1.   用 50mM  的碳酸盐包被缓冲液（pH 9.6）溶解抗原，使抗原浓度为 10-20 μg/ ml， 加 100 μl/孔到 96 孔酶标板， 4 oC 放置过夜。
2.   第二天弃去包被液后， 用 PBST 洗涤 3 次，每孔加入 150 μl  1％ BSA 37 oC
封闭 1 小时。
3.   PBST 洗涤 3 次后，每孔加入 100 μl 不同倍比稀释度的血清，并加入对照样
品， 37 oC 孵育 2 小时。
4.   PBST 洗涤 5 次后，加入 100μl 稀释后的 HRP 标记的二抗，37 oC 孵育 1 小时。
5.   PBST 洗涤 5 次后，显色剂显色 20min 后，酶标仪上读取 A405 吸收值。
二、包被细胞
1.   在 96 孔培养板上接种细胞数为 1 x 104  cells/well ，37℃过夜培养。
2.   第二天用 PBS 洗涤培养板 2-3 次。
3.   加入 125 µl/well 10% Formalin（1:10 稀释） , 室温下固定 15 min。
4.   用 ddH2O 洗涤培养板 3 次，并晾干，储藏在 2-8oC 备用。
5.   用 PBST 洗涤 3 次，每孔加入 150 μl 1％ BSA 37 oC 封闭 1 小时。
6.   PBST 洗涤 3 次后，每孔加入 100 μl 不同倍比稀释度的血清，并加入对照样
品， 37 oC 孵育 2 小时。
7.   PBST 洗涤 5 次后， 加入 100 μl 稀释后的 HRP 标记的二抗,37 oC 孵育 1 小时。
8.   PBST 洗涤 5 次后，显色剂显色 20min 后，酶标仪上读取 A405 吸收值。
50mM 的碳酸盐包被缓冲液： 0.05mol/L pH9.6 碳酸缓冲液,4℃,保存, Na2CO3 0.15 克, NaHCO3  0.293 克,蒸馏水稀释至 100 ml。
ABTS 作为底物进行显色反应(10ml)：
² 0.2M Na2HPO4 2.4ml
² 0.1M    柠檬酸 2.6ml
² ddH2O      5ml
² ABTS 5mg
² H2O2(30%)    4 ul（用前加入）
注 意：
² 一般做倍比稀释进行检测，需要有相应的对照血清。
² 不同的显色系统对应不同的光吸收值。

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