分子克隆：从认识质粒开始

心中u你

终于可以开开心心地做实验了呢~~于是来写写最近的分子克隆经验总结。
记得刚踏进生物分子领域之时，我那德高望重的教授曾郑重要求我们必须首先学会的三个技能：1.分子克隆，2.养细胞，3.Western blot（蛋白印记）。只要这三个东西齐活了那基本可以运转起一个生化实验室了。这三个技术非常难以精通，非常需要经验积累，只要精通了，那其他的实验上手更是指日可待。我自评的话，就只能说western blot还稍微跑的可以（笑），其他两个真是一塌糊涂。
三个技能之中基础的基础就是今天要写的分子克隆：分子，顾名思义就是DNA分子，克隆，顾名思义就是获得很多个这个分子的拷贝。翻译过来就是将你感兴趣的DNA分子纯化出来并扩增的方法。学会了分子克隆，你就会觉得自己拥有一双上帝之手，跨物种遗传当然没问题，再结合一系列的基因编辑基因技术，你想要改造寄主细胞，怎么表达一个基因，表达多久，表达的量多少，加什么标签，发个绿光还是发个红光，要不要整合到细胞的基因组上，都能自由发挥！
用体外重组方法将目的基因插入克隆载体，形成重组克隆载体，然后才能通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增[1]。



简易的分子克隆的连接流程

一. 什么是质粒
首先我们要介绍的就是分子克隆的重要载体，质粒（plasmid）。质粒通常被定义为圆形的、双链的染色体外DNA。我们知道，每个细胞都有一个细胞核或核区域，包含了细胞的所有遗传物质。但原核细胞，和一些真核细胞，拥有额外的DNA，从他们的核区域的DNA分离。这个额外的DNA被称为质粒。它是双股的，通常是圆形的，这意味着它连接在一起形成一个圆。



一个细菌的DNA和质粒

根据功能不同将质粒分为5种不同类型的育性质粒、抗性质粒、col质粒、毒力质粒和代谢或降解质粒。

二. 为何选择质粒[2]
其一，质粒不仅仅是修饰细菌和酵母等生物，质粒也可以在正常的细胞分裂过程中随细胞一起复制，也可以自行复制。
其二，它们很容易从宿主细胞中分离出来。
其三，质粒上可以进行特别的标记。这些标记是附着在载体上的DNA片段。这些有助于标记哪些宿主细胞已经获得了重组DNA，因为它们通常会带来明显的变化，比如颜色的变化，对特定抗生素的新耐药性，等等。有这样的标记十分利于筛选和鉴别。
其四，质粒存在重组DNA所需的某些区域，如复制起点(origin of replication),这个一会儿在图谱里会提及。
其五，质粒在尺寸上相比于基因组是很小的，最大的质粒也才1000kb，它们相对来说更加易于研究和操作。这无疑是献给分子生物学家的一份礼物。尤其是近年来不断发展的来自细菌的各种奇奇怪怪功能的酶，稍加改造，甚至改变整个行业现状，我自己做过的系统就有Crispr和cre-loxp,以及transposon（转座子系统很有意思，被称作基因里的小偷家族，有机会我单独写一篇）。

三. 如何阅读一个质粒图谱



科幻电影里是这样。



但实际上是这样的。

所有的天然质粒都包含一个复制起点(它控制着宿主的范围和质粒的拷贝数)，通常还包括一个有利于生存的基因，例如抗生素抗性基因。相比之下，实验室使用的质粒通常是人造的，目的是将外来DNA引入另一个细胞。实验室创造的质粒至少有一个复制起点、选择标记和克隆位点。常用的软件是snapgene, 不仅可以标记质粒序列还可以编辑一系列DNA序列。显示方法可以为环形和线形。阅读质粒图谱的要点如下：
1.质粒的名词和大小显示在图谱中间
2.构成质粒的基本要素：
ORI(origin of replication)：Ori是指质粒复制的起源，使质粒能够复制自己，因为它必须在细胞内。DNA序列通过激活细菌的转录机制参与到复制的起始阶段，一个载体只可能存在一个ori。无论你如何改造质粒，都不要改变这个位点。ORI的最佳选择取决于你想要维持多少个质粒拷贝，你打算使用哪一个或哪几个宿主，以及你是否需要考虑你的质粒与一个或多个其他质粒的兼容性。一般来说，具有相同胞核的质粒是不相容的，因为它们会争夺相同的复制机制，造成不稳定和不可预测的环境。因此，来自同一组的质粒不应该进行共转化，所以如果你需要两个质粒来做一个实验，确保它们ORIs是兼容的。
Antibiotic resistance gene：抗生素抗性基因，允许在选择性培养基中挑选含有质粒的细菌。



常用的抗性基因

Promoter region：启动子区。转录过程中RNA聚合酶的结合位点，驱动目标基因的转录。表达载体的重要组成部分:决定基因表达的细胞类型和获得的重组蛋白数量。因为转录机制在不同的细胞类型或生物体之间是不同的，启动子也是不一样的。细菌启动子只在原核细胞中起作用，而且通常只在其来源的相同或相近物种中起作用。同样，各种真核细胞类型(哺乳动物、酵母、植物等)需要独特的启动子，很少有交叉。一般来说，细菌中的启动子种类较少，结构也不复杂，比真核细胞中的启动子少。一些启动子是构成性激活的，并且一直处于激活状态，而另一些启动子则受到更严格的控制。也有一些常用的启动子是真核生物和原核生物共兼容的，比如CMV Promoter, EF1a promoter, SV40 promoter 等等。
Terminators and polyA signals: 终止子和polyA信号。我们之前讨论过promoter在基因转录起始阶段的作用;终止子是调控转录是如何停止或终止的。一般来说只要有终止密码子，转录就会自行终止，并启动从转录机制释放新合成的RNA的过程。终止子在基因下游被转录，通常直接发生在任何3个调控元件之后，如聚腺苷酸化或聚(A)信号。虽然许多研究集中于启动子强度作为基因表达水平的决定因素，但终止子在RNA处理中也发挥着重要作用，并有助于RNA半衰期的变化，最终实现基因表达。聚腺苷酸化，顾名思义，是多腺嘌呤(A)核苷酸转录后附加到信使RNA转录本的尾部。多聚腺苷酸化的目的和机制因细胞类型而异，但多聚腺苷酸化通常用于促进真核生物的转录本寿命和促进原核生物的转录本降解。
Multiple cloning site(MCS)：多克隆位点。DNA的短片段，包含几个限制位点，便于DNA的插入。在表达质粒中，MCS通常位于启动的下游。
Insert：插入片段。你感兴趣的基因、启动子或其他DNA片段被克隆到MCS中以供进一步研究。
Selectable marker：可选标记。抗生素抗性基因允许在细菌中进行选择。许多质粒也有用于其他细胞类型可选择的标记。
Primer binding sites：引物结合位点。一种短的单链DNA序列，用作PCR扩增或测序的起始点。
Methylation and Restriction enzymes: 甲基化和限制性内切酶。
甲基化会影响限制性内切酶的功能， DNA甲基化在特定的序列，以防止他们被限制内切酶降解，因此选择酶切位点之前一定要仔细核对甲基化的位置。常见的甲基化修饰类型：Dam甲基化酶在DNA的GATC延伸腺嘌呤上添加一个甲基基，Dcm甲基化酶在CCWGG的第二个胞嘧啶上添加一个甲基基，EcoKI甲基化酶在aacnnnngtgc或GCACNNNNNNGTT中给腺嘌呤添加一个甲基基团。
限制性内切酶位点一般会在图谱里标注出来，切割方法是将糖类分子与磷酸之间的键结切断，进而于两条DNA链上各产生一个切口，且不破坏核苷酸与碱基。切割以后会形成粘性末端。不同的酶会识别不同的位点，形成不同的粘性或者钝末端。限制性内切酶可真是贵啊。一般一个实验室常用的就那几个。



一些限制性内切酶的切割位点

Multicistronic vectors: 多顺反子。在许多实验环境中，你可能需要一个载体表达多个基因。为了实现这一目标，科学家们使用了多种技术，包括两个或多个质粒的共转染，使用多个或双向启动子，或创建双顺反子或多顺反子载体。不同于启动子将为每个表达的基因创建独特的mRNA转录，多顺反子载体同时表达来自同一mRNA的两个或多个分离的蛋白质。不同于载体表达可筛选的或可选择的来自唯一启动子的标记，多顺反子质粒确保任何标记为阳性的细胞也表达你的基因，因为它们都来自相同的转录本。常见的多顺反子包括IRES（Internal Ribosome Entry Site）和2A Peptides（P2A, T2A,E2A or F2A）。



IRES 和2A隔在两个基因中间，分别形成两个单独的转录本，分别翻译成蛋白质

3. 图谱帮助我们识别各种片段在质粒内元素的相对位置：质粒元件的相对位置是通过限制映射或测序绘制的。
4. 明确启动子的方向：启动子在质粒内的定位对于决定质粒中所有其它元素的定位，特别是插入基因的定位非常重要。转录是在启动子的3端开始的。因此，基因应该在适当的方向才能被表达。
自己制作的质粒图谱往往不可靠，也许会忽略一些看起来不是那么重要的特征，因此一定要十分清楚质粒的来源，最好使用Addgene、Entrez-PubMed等已知的图谱存储库，以及参考出售你感兴趣的载体的公司的网站[3][4]。

四. 改造质粒的前期准备[5]
1.根据功能选择合适的骨架backbone。一些常见的质粒类型包括克隆质粒、表达质粒、基因敲除质粒、报告质粒、病毒质粒和基因组工程质粒。迄今为止，世界各地的科学家广泛使用这些载体进行实验，包括荧光成像、重组DNA技术、大规模蛋白质生产、疾病建模、药物发现和基因组编辑。
2.选择合适的限制性内切酶位点。你选择的位点应该是唯一的，这是为了避免连接过程中的自连，此外衍生载体往往包含额外的序列，你也许会将它遗忘。当使用限制性内切酶位点将你感兴趣的基因克隆到你的质粒时，要注意观察哪些位点属于你的抗生素抗性基因。基因的破坏会导致抗生素耐药性基因功能的失活。
3.确认转录方向：如果你在另一个基因的中间克隆了你感兴趣的基因，确保这两个基因的转录方向相同。



一个名为pBR322的载体骨架，中间是大小，红色是序列，黑色箭头显示转录方向，蓝色标记是限制性内切酶识别位点

五. 质粒的构建[6]。
1.将感兴趣的片段利用PCR克隆下来，切好备用的backbone。引物的设计也是一个难点，需要不断摸索，此外为了防止自连，最好选择两个不同的限制酶酶切位点。
2.插入。为了将感兴趣的基因插入载体，科学家可以利用各种克隆方法中的一种(限制性内切酶、独立连接、Gateway、Gibson等)。



图示一种利用限制性内切酶的粘性末端连接的方法。

3.在细菌中扩增。最终是根据你想要克隆的质粒来选择的。无论如何，一旦克隆步骤完成，含有新插入基因的载体被转化为细菌细胞，并选择性地生长在抗生素板上。
4.检测是否连接成功的方法是酶切鉴定和测序。
最后，你就可以开始设计下一步实验了。
参考

• ^https://www.sciencelearn.org.nz/resources/527-how-to-add-foreign-dna-to-bacteria
  
• ^https://www.scienceabc.com/pure-sciences/what-are-plasmids-why-are-they-important.html
  
• ^https://pediaa.com/how-to-read-a-plasmid-map/
  
• ^https://blog.addgene.org/plasmids-101-what-is-a-plasmid
  
• ^https://bitesizebio.com/43119/the-beginners-guide-to-reading-plasmid-maps/
  
• ^https://www.addgene.org/protocols/dna-ligation/
  

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/141621053