基因过表达构建攻略（二）

空白派

构建好目的质粒后，为确保质粒足量且无内毒素。

宜用获得的目的质粒进行转化，摇菌，质粒提取（采用无内毒素的中提或者大提试剂盒）。

这里简要说明下原因：从控制实验成本角度来说，在送出测序前的质粒提取（攻略一中提及）采用的是快速质粒小提试剂盒，该试剂盒价格低廉，但是对内毒素的去除效果及质粒提取的量是无法满足后续实验（包装慢病毒）需求的。所以需要用去内毒素的中提或者大提试剂盒对目的质粒再次提取。如果实验室经费特别充裕，或是出于节省时间考虑，在构建之初就用去内毒素的试剂盒提取足量质粒，则无需二次提取了。

转化前的准备：

制备选择性固态平板：称量2克Tryptone;1克Yeast extract;2克Nacl;2克琼脂糖，转移到500ml三角瓶，向瓶内倒入200ml双蒸水，用无菌透气封口膜及橡皮筋扎好瓶口。放入实验室高压锅内，121度高压半小时后取出（做好防护不要被烫伤），待温度降至60度左右（以不太烫手作为粗略标准）加入200μl 氨苄（浓度100mg/ml）。值得注意的是不是所有的选择性平板都是加入氨苄，具体选择哪种抗生素应该以质粒的抗性为准！！！）

将添加了氨苄的培养基倒入10cm的培养皿（平板），每个培养皿倒入10ml左右，冷却凝固后待用。

LB培养基配制：通常和选择性固态平板同时配制。称量1.5克Tryptone;0.75克Yeast extract;1.5克Nacl,转移到250ml三角瓶，向瓶内倒入150ml双蒸水，用无菌透气封口膜及橡皮筋扎好瓶口。放入实验室高压锅内，121度高压半小时后取出（做好防护不要被烫伤）,备用。

转化（沿用攻略一）：以stable3感受态细胞为例，从-80冰箱取一支stable3感受态细胞，置于冰上解冻，数分钟后加入2微升质粒，轻柔混匀，冰上放置30分钟，42度水浴90秒（或者45秒），该步骤称为热激，冰上放置2分钟，加入500微升SOC（购买的stable3感受态细胞会附带SOC）或者LB培养基。放入摇床，设置37度200rpm转速复苏一小时。

将复苏好的感受态细胞以300G转速离心5分钟，弃上清，留下50至100微升液体，吹匀后将菌液加入带相应抗性（根据质粒抗性而定）的选择性固体培养基（常用的是氨苄），用接种环划线，静置数分钟，倒置平板放入37度培养箱，12-16小时后取出已经长出细菌的选择培养基平板。

在备用的LB培养基加入150μl氨苄（浓度100mg/ml），用灭菌枪头挑取一个单菌落，连枪头一起加入含LB培养基的三角瓶中，重新用无菌透气封口膜和橡皮筋扎好瓶口。37度摇床200rpm转速摇菌，12-16小时后取出。

质粒提取：参加相应试剂盒说明书，国内天根试剂盒用得挺多，这里贴一个说明书吧

http://tiangen.com/asset/imsupload/up0328126001604555759.pdf

质粒提取后，用Nanodrop测浓度。

包装病毒：

293T细胞培养：293T细胞是人肾上皮细胞系接受人工改造后得到的，它含有SV40复制起始点与启动子区（SV40有着增强基因转录的作用），表达SV40大T抗原。目前很多质粒都有SV40复制起始点，也就意味着可以在293T细胞中表达外源基因。293T细胞培养很简单，DMEM培养基加10%胎牛血清加1%的双抗，注意刚引进实验室的细胞均应进行支原体检测，防止应支原体污染导致293T细胞转染效率低。

转染：
注意：每个实验室使用的包装方法和细节可能有所不同，以下方法仅供参考

转染前一天对293T细胞进行传代，确保第二天293T细胞密度能达到80%-90%。以10cm 培养皿为例，在转染前两小时吸出旧培养基，更换为10ml DMEM加10%胎牛血清无双抗培养基，应从侧壁缓慢加入，避免细胞脱落（了解到部分实验室不换液，或者换含双抗培养基，故该步骤酌情处理）。

转染试剂可使用Lipofectamine 2000或者PEI(线性聚乙烯亚胺)

（1）首先按照
5.6微克 psPAX2
2.4微克 pMD2.G
8微克 of lenti plasmid（目的质粒）
加入OptiMEM培养基（OptiMEM挺贵的，如果预算有限，也可以用普通DMEM培养基代替），使得总体积为1200μl。

（2）然后另备一管，加入40μg Lipofectamine 2000或者40μl PEI(10mg/ml)到1160μl OptiMEM培养基,室温孵育5min。

（1）（2）混合后室温孵育20-30min,缓慢将混合物加入293T细胞。放入37度培养箱。16小时后吸出培养基，加入10ml病毒收获液（DMEM + 10% FBS + 1% Pen/Strep + 1.1g BSA/100mL，BSA可酌情选择添加），37度培养箱培养24小时后收获上清液（该上清即为病毒液），将上清液加入50ml离心管，4度保存。再次向293T细胞中加入10ml病毒收获液，24小时后收获，加入第一次上清液收集管，1200rpm离心5min，使用0.45μm过滤器过滤（该步骤主要目的是去除混入的293T细胞），滤过液即为包装好的慢病毒

感染细胞：获得包装好的慢病毒后，可根据需要检测滴度及MOI，这里贴一个检测方法，可以参考。

http://fulengen.com/wp-content/uploads/2016/03/User-manual-of-lentiviral-particles.pdf

这里主要谈一下实验步骤

第一天：接种细胞（如肺癌，卵巢癌细胞）至6孔板，保证第二天细胞密度能达到50%左右

第二天：根据病毒滴度及MOI确定好病毒原液稀释倍数（该步骤为了避免病毒浓度过高对细胞造成损伤，过低感染效果不好，因而需找到合适的稀释比例），弃去6孔板旧培养基，加入2ml含病毒培养基，加入10ug polybrene,提高感染效率。8小时后更换新的完全培养基（因细胞不同，可适当调整时间）

一般来说，感染后48h,基因就可以检测到表达。如果带有GFP(绿色荧光蛋白)，RFP(红色荧光蛋白)的话，可以通过荧光显微镜观察。

接下来，我们就要筛选出稳定表达的细胞，如果带有抗性基因，如Puromycin（嘌呤霉素），我们可以用Puromycin对细胞进行筛选（浓度1～10 μg/ml，根据细胞而定），杀死无抗性的细胞，从而获得稳定表达细胞。

如果仅含GFP或者RFP,不带抗性基因，则可用流式分选，获得目的细胞。

最后，我们需要检测目的基因是否过表达，可用qPCR或者WB检测，如果符合预期，就及时冻存细胞，这样过表达细胞就构建好了。

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