【5分钟讲透实验】影响免疫荧光（IF）实验结果的因素综述

John

免疫荧光染色技术是一种以免疫学为基础，结合生物化学技术和显微技术发展而来的蛋白等分子检测技术。
被广泛应用于细胞生物学、微生物学、寄生虫学、免疫学等科学研究，以及临床诊断方面。





IF质量影响因素分析

以下将从荧光染料、抗体、样品前处理、染色过程等方面阐述如何提高免疫荧光染色的质量，以获得高清晰度的图片。

01实验准备

1. 免疫荧光染色方法的选择
免疫荧光染色技术分为直接法和间接法。
直接法：将荧光标记物偶联在抗原/抗体上，直接与相应的抗体/抗原反应。
间接法：先用未标记的一抗与抗原充分反应后，再利用荧光标记的二抗与已经结合在抗原上的一抗结合，达到检测抗原的目的。



2. 抗体的选择
与目标蛋白直接结合的一抗，在条件允许的条件下，尽量选择相同来源的免疫原或者选择已验证种属反应性的抗体。
如果进行不同目标蛋白的双染或多染时，这些不同蛋白所对应的一抗应该来源于不同宿主。


单克隆抗体与多克隆抗体、种属免疫原、反应性和抗体的宿主来源是抗体选择最主要考虑的因素，其直接决定着免疫荧光染色的背景、特异性和成败。荧光偶联的二抗应选择与一抗相对应的抗体，及抗一抗的二抗。

3. 荧光染料的选择
染料的选择应与激光共聚焦显微镜所配激光器的激发波长相匹配(350、405、458、488、514、561、633nm)，当需要多重荧光标记时，这些荧光探针的激发波长或发射波长尽量相差大些，可以区分开。


FITC荧光强度极易受到pH影响，且易淬灭，在荧光染料选择中，常用AlexaFluor488或者CF488A替代。
在进行双重或多重免疫荧光染色时，一般先通过ThermoFisher等网站上的荧光光谱查看器进行预选择，不同荧光的激发波长或发射波长尽量无交叉，防止串色，影响试验结果的准确性。

4. 抗体保存
防止荧光抗体失活、污染以及荧光染料的脱落和淬灭。
在抗体保存过程中，适量分装，避免反复冻融。
蛋白极易被塑料等吸附，如果用塑料管分装，抗体中应添加BSA等。
为防止污染也可以添加0．01%的硫柳汞或者0．1%的叠氮化钠。
为防止淬灭，保存荧光抗体时应该注意避光，可以利用锡箔纸包好，或者放在避光的容器中。

5. 培养载体的选择
根据贴壁情况，细胞可分为贴壁细胞和悬浮细胞。
贴壁细胞一般常用24孔细胞培养板培养，接种细胞前放置0.17mm玻璃细胞爬片。
悬浮细胞常用6孔板培养，免疫荧光染色处理后，取少量加在0.17mm玻璃细胞爬片上。
最后将细胞爬片倒扣到载玻片上，封片，放4℃保存。

02免疫荧光染色

1. 细胞固定
免疫荧光染色常用的固定剂有甲醛、多聚甲醛、戊二醛、丙酮、乙醇、甲醇等。



2. 透膜处理
TritonX－100作为免疫荧光染色最为常用的透膜剂，其实质是一种非离子型表面活性剂，能够溶解脂质，增强细胞膜的通透性，便于抗体进入细胞内。
如果需检测的目的蛋白属于胞内蛋白或者抗原抗体结合位点位于胞内的跨膜蛋白，抗体孵育前需进行透膜处理。
TritonX－100浓度和透膜时间并非越大或越长越好，时间过短或浓度过低，会造成透膜不充分，抗体进入胞内不足，荧光强度低，图像不清晰。相反，浓度过高或透膜时间过长都会造成细胞骨架结构解离，致使显微镜下无法检测到骨架结构或只检测到少量蛋白残基。

3. 样品封闭
封闭处理的目的通常是减少抗体的非特异性结合，如非特异性抗体与内源Fc受体(FcＲ)结合或与其他物质之间的离子作用或疏水作用等。
最常用的封闭液有1%～5%的BSA溶液、脱脂奶粉溶液或血清溶液。
同时也有相关研究认为传统意义上的样品封闭步骤在免疫荧光染色中是没有必要的。

4. 抗体孵育
抗体孵育目的是使抗体充分与目的蛋白抗原结合，其结合程度直接影响着免疫荧光染色的效果。
通常37℃孵育1～2h，可根据蛋白表达量的多少适当调整时间，或者一抗4℃过夜。
一般情况下，环境温度的升高对免疫荧光染色有明显的影响，随着温度升高，荧光淬灭的可能性增大，因此适当的低温环境对于免疫荧光染色和观察效果更好。

5. 洗涤
在细胞进行固定处理前要用37℃PBS洗涤3遍，每遍1min，以减少细胞的应激和去除附着的杂质。
固定后和透膜后各洗涤3遍，每遍2min，去除其中的固定剂和TritonX－100，封闭后的封闭液无需洗涤，只需用移液器吸净。
孵育二抗前，要充分洗净一抗，防止二抗与残留的一抗结合，影响结果的准确性，也可减少背景色。二抗孵育结束后，再充分洗涤残留的二抗。

6. 封片
封片时添加少许防淬灭剂可防止样品淬灭。
常用甘油和PBS等量混合，因每种荧光染料适应于不同的pH，建议封闭液使用前调整pH直至荧光染料的最适pH。
常用商品化的防淬灭剂有ProlongGold、Mowiol、Vectashield和DABCO/NPG等。



7. pH
荧光素在溶液状态下基本处于离子化状态，故维持荧光素与溶剂之间的电离平衡至关重要。
溶液的pH对免疫荧光强度影响极大，不同的荧光素标记物都有自己适合的pH，pH改变能够影响荧光素的荧光强度，在进行免疫荧光染色时要注意荧光素标记物适宜的pH。

IF操作注意事项




IF常见问题及解决方案






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