流式细胞术的原理、应用及分析整理——检测细胞周期

John

今天我们讲来讲解检测细胞周期的相关技术
<hr/>细胞周期就是从细胞分裂产生的新细胞生榨开始到下一次细胞分裂形成子细胞结束为止所经历的过程，主要分为G0、G1、S、G2、M期
G0——是细胞处于相对静止时期的细胞，细胞暂时不参与细胞的增殖而执行一定的生物学功能
G1——DNA合成前期，为细胞下一次有丝分裂准备DNA合成所需要的各种物质和能量，细胞仍然是二倍体
S——DNA合成期，是细胞周期的最关键时期，DNA的量经过复制增加一倍，DNA也从二倍体到四倍体的连续增加
G2——DNA合成的后期，此时DNA 的合成已经完成，为下一步有丝分裂做准备，细胞为四倍体
M——细胞分裂期，在分裂完成之前仍然为四倍体
非特异性核酸荧光染料标记法

非特异性核酸荧光染料介绍

• 分类：细胞膜非通透性染料+细胞膜通透性染料
  
• 细胞膜非通透性染料——不能自由进入细胞膜完整的细胞，所以标记时需要通过固定等方法增加细胞膜的通透性，使得染料能够进入到细胞内与核酸结合，但经过处理后的细胞一般都丧失了活性，所以此染料不能用于流式分析，此类染料使用最为广泛的是PI染料
  
• 细胞膜通透性染料——能够自由进入细胞膜完整的细胞内，可直接标记活细胞，此类荧光染料包括：Hoechst、DAPI、DRAQ5
  

PI标记法检测细胞周期

PI染料即碘化丙啶，是检测细胞周期最为广泛的荧光染料，能够与细胞内的双链DNA和RNA相结合，被488nm激光激发后发射红荧光，与核酸结合后发射荧光的能力提高20-30倍。PI染料不能随意穿过细胞膜，标记时需要用乙醇固定使得细胞膜的通透性增加，同时需要加入RNA酶来消化细胞内的RNA，确保PI只能和DNA相结合，反映细胞DNA的含量来确定细胞周期

• 注意点：检测细胞内的DNA含量需要确保样品内的细胞都是单细胞状态，但在实际状况中会出现粘连的双细胞和多细胞团块，而在流式检测时就会将二倍体当做四倍体的状况，如果粘连较多就会影响检测的结果
  
• 处理方法：1）样品中适当加入EDTA，减少细胞之间的粘连 2）流式上样前，用40μm的滤网过滤 3）尽量降低上样速度，避免流式细胞仪将两个相邻的细胞当做一个细胞 4）在FCS-SSC物理图中首先对目标细胞群进行框选
  

AO染料标记法区分五期细胞

AO即吖啶橙，只分析DNA含量只能区分DNA不同的时期，不能分析DNA含量相同时期。利用AO染料可以与双链核酸结合，也能够与单链核酸结合。双链结合后主要发射绿色荧光，单链结合后主要发射红荧光。

• 方案一——G0和G1期细胞的DNA含量相同，但是RNA含量相差较多，G1期细胞的RNA含量是G0期细胞的很多倍
  
• 方案二——利用RNA酶降解细胞的RNA，然后用加热或酸化的方法使细胞内的DNA部分变性，最后标记AO染料，AO结合未变性的双链DNA后发射绿色荧光，结合变性的单链DNA后发射红色荧光。G0期细胞DNA比G1期细胞更容易变性，M期细胞的DNA比G2期细胞更容易变性，此方案可以区分出五期细胞
  

特异性细胞周期调节蛋白检测法

• 原理：细胞周期蛋白（cyclin）、细胞周期蛋白依赖的激酶（CDK）、CDK的抑制剂（CKI）、视网膜母细胞瘤（Rb）家族蛋白和泛素介导的蛋白水解复合物APC或SCF都是与细胞周期相关的蛋白质分子，其分泌水平在细胞周期的不同阶段有所不同。DNA含量检测的同时标记荧光素偶联的这些蛋白质分子的单克隆抗体，利用流式细胞术进行检测
  
• G0——不表达cyclinD和cyclinE，Rb蛋白的磷酸化水平较低，借此可以将同为二倍体的G0和G1期细胞相区分
  
• M——最好的标志是磷酸化的组蛋白H3，磷酸化的MPM-2也是M期标志
  

<hr/>今天我们讲解了与检测细胞周期相关的原理和技术，接下来我们将讲解细胞杀伤能力的检测方法

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