流式细胞术的原理、应用及分析整理——分选设门、步骤

虎威将军

上此文章中我们讲解了流式分选的模式以及上样的速度方面知识的讲解，今天我们将介绍流式分选的设门以及步骤。
<hr/>分选设门的基本原则

• 原理——分选设门就是在流式图上圈出所要分选的目标细胞的过程，分选型流式细胞仪根据流式图上的设门的信息在分选过程中判断细胞是目标细胞还是非目标细胞。
  
• 正确设门的前提——首先需要真正的理解流式图，我们分析流式图时应该用“群体性”的概念去理解流式图所代表的细胞，应该将散点图上的细胞分为若干群体，分析细胞群各自代表什么类型的细胞而不是只关注散点图上的某个点
  
• 同一细胞荧光表达量不同的原因——当激光照射到该细胞时，由于该细胞不是出于可见液流的正中央，该细胞收到水流的作用处于不规则的状态，或激光刚好照射到细胞表面抗原分子的集中点等原因导致这个细胞流式数据与真实情况不相符，流式数据可能偏大或偏小。
  
• 散点图中细胞分布——散点图中X轴和Y轴表示的两个抗原分子分布相同的细胞群的两个数轴上都是正态分布的，表现在散点图上就是一个圆。越靠近圆心细胞就越密集，越到周边细胞就稀少。代表细胞的点可能位于圆的不同位置，但是不同位置的这些点所代表的细胞表达两个荧光通达所代表的抗原分子是相同的，并不是抗原表达量有差异
  

流式分选基本步骤

• 将样品制备成单细胞悬液，尽量减少死细胞、细胞碎片和小颗粒性物质的比例
  
• 荧光素偶联抗体标记样品细胞，4℃静置30min。标记样品细胞的同时可以开始调节流式细胞仪
  
• 开启空气压缩机和负压泵，开启液流系统，然后“打点”可见液流
  
• 开启激光器，调节激光光路，使得激光正好穿过可见液流的正中央，保证最为理想的激光激发状态
  
• 调节液滴延迟，保证仪器对于液滴的处理能够正确作用到相应的液滴上
  
• 上样75%的乙醇，保证上样管道处于无菌状态，消毒接收仓保证接受仓内环境处于无菌状态
  
• 上样用于设置阴性对照的样品细胞，列出所需要的各种流式图，根据阴性对照的荧光结果标定各荧光通道的阴阳界限
  
• 上样标记有荧光素偶联抗体的用于分选样品细胞，得到流式结果，暂停上样，根据所的流式结果在流式图上圈出所需要分选的细胞，并设定各自分选的模式和使用哪一路进行分选
  
• 用含有血清的培养基润湿接收管，并留下少量的培养基在接收管中，保证在接收过程中能对分选的细胞起到缓冲作用，防止因机械碰撞而损伤细胞，后将该接收管置于接收仓中的相应位置用于接收分选的细胞
  
• 重新上样，开始分选。分选时注意接收管的状态随时准备用新的接收管替换已满的接收管
  
• 如分选流式细胞仪配备温控系统，应保证细胞均处于4℃，以确保细胞的活力
  

<hr/>接下来我们将对流式分析术的相关应用进行相应的讲解。

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/611897221