微生物常见检测方法大全

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来源：“药物微生物检验”公众号
原标题：《微生物常见检测方法大全》
微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义。常见的检测方法有：生长量测定法、微生物计数法、生理指标法和商业化快速微生物检测等，本文主要介绍常用的检测方法的的原理，应用范围和优缺点。
微生物生长意味着原生质含量的增加，所以测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，可以从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。


生长量测定法

1、体积测量法：又称测菌丝浓度法。
原理：通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。
菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。
2、称干重法：
原理：利用离心或过滤法测定。一般干重为湿重的10-20%。称干重发法较为烦琐，通常获取的微生物产品为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母（activity  dry  yeast, ADY）,一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。
3、比浊法：
原理：微生物的生长引起培养物混浊度的增高。通过紫外分光光度计测定一定波长下的吸光值，判断微生物的生长状况。该法主要用于发酵工业菌体生长监测。
4、菌丝长度测量法：
方法：对于丝状真菌和一些放线菌，可以在培养基上测定一定时间内菌丝生长的长度
微生物计数法

1、血球计数板法:
这种方法简便，直观，快捷，但只适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子进行计数，并且所得结果是包括死细胞在内的总菌数。
2、染色计数法：
为了弥补一些微生物在油镜下不易观察计数，而直接用血球计数板法又无法区分死细胞和活细胞的不足，人们发明了染色计数法。
3、比例计数法：
将已知颗粒（如霉菌孢子或红细胞）浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，即可得未知菌液的细胞浓度。
4、液体稀释法：
对未知菌样做连续十倍系列稀释，根据估计数，从最适宜的三个连续的10倍稀释液中各取5毫升试样，接种1毫升到3组共15只装培养液的试管中，经培养后记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查最大或然数表MPN（most probably number）得出菌样的含菌数，根据样品稀释倍数计算出活菌含量。该法常用于食品中微生物的检测，例如饮用水和牛奶的微生物限量检查。
5、平板菌落计数法：
这是一种最常用的活菌计数法。但方法比较麻烦，操作者需有熟练的技术。平板菌落计数法不仅可以得出菌液中活菌的含菌数，而且同时将菌液中的细菌进行了一次分离培养，获得了单克隆。
6、试剂纸法：
在平板计数法的基础上，发展了小型商品化产品以供快速计数用。试剂纸法计数快捷准确，相比而言避免了平板计数法的人为操作误差。
7、膜过滤法：
用特殊的滤膜过滤一定体积的含菌样品，经丫叮橙染色，在紫外显微镜下观察细胞的荧光，活细胞会发橙色荧光，而死细胞则发绿色荧光。
生理指标法

微生物的生长伴随着一系列生理指标发生变化，例如酸碱度，发酵液中的含氮量，含糖量，产气量等，与生长量相平行的生理指标很多，它们可作为生长测定的相对值。
1、测定含氮量：
大多数细菌的含氮量为干重的12.5%，酵母为7.5%，霉菌为6.0%。根据含氮量×6.25，即可测定粗蛋白的含量。含氮量的测定方法有很多，如用硫酸，过氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas测氮气法。
2、测定含碳量：
将少量（干重0.2-2.0 mg）生物材料混入1毫升水或无机缓冲液中，用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在100 0C下加热30分钟后冷却。加水稀释至5毫升，在580nm的波长下读取吸光光度值，即可推算出生长量。需用试剂做空白对照，用标准样品做标准曲线。
3、还原糖测定法：
还原糖通常是指单糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通过还原糖的测定可间接反映微生物的生长状况，常用于大规模工业发酵生产上微生物生长的常规监测。
4、氨基氮的测定：
方法是，离心发酵液，取上清液，加入甲基红和盐酸作指示剂，加入0.02N的NaOH调色至颜色刚刚褪去，加入底物18%的中性甲醛，反应数刻，加入0.02N的使之变色，根据NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根据培养液中氨基氮的含量，可间接反映微生物的生长状况。
5、其他生理物质的测定：
P，DNA，RNA，ATP，NAM（乙酰胞壁酸）等含量以及产酸，产气，产CO2（用标记葡萄糖做基质），耗氧，黏度，产热等指标， 都可用于生长量的测定。也可以根据反应前后的基质浓度变化，最终产气量，微生物活性三方面的测定反映微生物的生长。
商业化快速微生物检测法

微生物的检测，其发展方向是快速，准确，简便，自动化，当前很多生物制品公司利用传统微生物检测原理，结合不同的检测方法，设计了形式各异的微生物检测仪器设备，正逐步广泛应用于医学微生物检测和科学研究领域。例如：
      1、抗干扰培养基和微生物数量快速检测技术
      2、BACTOMETER 全自动各类总菌数及快速细菌检测系统
这些仪器和设备的生产厂家很多，产品各异，在此不做一一介绍，具体可查看各公司的产品说明。
在微生物检验操作过程中，要保证检测环境(如超净台、检测室)以及所用工器具的洁净程度，同时保证人员各种操作的规范性，尽量保证其无菌性，防止因人为原因操作失误而出现误差结果，同时在适宜温度进行培养，为合理决策和指导生产提供依据。为保证检测结果的准确性，我们应做好以下几个方面。
培养基的灭菌及使用

1.每次配制时，要注意其生产日期是否在保质期内，查看其开瓶日期及瓶口密封性，保证其未变质，并且未吸潮。
2.培养基配制时，称量要准确，包括盐水的分装要准确。
3.一定要保证现配制现灭菌，未灭菌的配好培养基不能长时间放置，更不可隔夜。
4.灭菌时要保证恒温、恒压，同时要保证有效的灭菌时间。
5.灭菌过的培养基要冰箱保存，可保存一周，一般不超过 3 天。而且要遵循“先入先出”原则，先配制的要先使用。
6.在使用时，要根据当班次的使用量，用水浴锅先将培养基溶化为液态，然后及时调低水浴温度（先化好的可从水浴取出，放在水浴锅锅盖上）待用，千万不可长时间使培养基处于高温状态。
7.做产品微生物检测时，倾倒培养基温度在 45℃左右，不可过烫，避免将菌烫死；也不可过凉，化好的培养基又结块凝固，不便于观察结果。
8.每瓶培养基均要做空白。
9.尽量集中做样，避免频繁打开同一瓶培养基瓶塞，增大培养基的污染几率，出现误差结果。
10.培养基剩余过少时，可先将其倾倒成空白用板。
检测环境的维持

1、大环境（检测室）
（1）检测时，窗户和空调要关闭，或用酒精对房间进行喷雾消毒，避免房间内空气流通影响超净台内部环境（最好在有通排风系统的恒温恒湿无菌间进行操作）。
（2）如果在原来的原料微生物检测室进行检测，要定期开启紫外灯，对房间进行杀菌。
2、小环境（超净工作台）
1.定期清洁初效过滤器，要及时更换。
2.检测前，将超净台内部进行清洁，用 75%酒精进行擦拭消毒，并提前半小时将超净台紫外灯打开，对超净台内部环境进行杀菌。
3.关紫外灯，开风机，调整合适进风量，风量不可过低。
4.每次检测后，要对超净台内部进行清理、清洁，并用 75%酒精进行擦拭消毒。
5.紫外灯根据其使用寿命要及时更换。
6.检测同时，要做上相应菌落检测的环境空白。
7.检测区域的选择：
      a、一般在距离超净台外沿的 1/3-2/3 区域进行无菌操作；
      b、要在酒精灯火焰的外焰保护区域进行操作。
工器具的洁净度

1.玻璃器皿：采用干热灭菌方式进行灭菌。
2.检测用剪刀、勺子等物品要做到检测专用，不可与其它操作器具混用，使用时，先用75%酒精消毒，再采用灼烧方式进行灭菌。
3.接种针（环）采用灼烧方式进行灭菌，但要注意检测时要先将接种针（环）进行冷却。
样品的采集及检测

1、保证采样器具的无菌性
   （1）玻璃器皿：采用干热灭菌方式进行灭菌，保证恒温、时间足够（但不可时间过长，容易导致玻璃器皿易裂纹而报废）。
   （2）取样筐：使用前要用75%酒精进行喷洒消毒。
   （3）取样勺：要保证其清洁消毒，清洁后用75%酒精进行擦拭消毒。
   （4）取样袋：可先用酒精进行擦拭消毒，再在超净台用紫外灯照射消毒，（包装车间要在传递窗用紫外灯照射消毒）。
   （5）电子称表面用 75%酒精消毒。
2、人员操作
   （1）保证手部的清洗、消毒：取样前及检测前都要先洗手再消毒。
   （2）取样要具有代表性（随机样、目的样、综合样）且要标示清楚。
   （3）取样完毕，不可在车间逗留，要及时将样品放入超净台，对其外表面进行紫外灯照射消毒。
   （4）在要求的检测区域进行操作。
   （5）检测前，要用 75%酒精棉球对样品袋口部进行擦拭消毒，再开口。
   （6）往盐水瓶加样品时，要注意勺子或袋子尽量不接触瓶口。
   （7）样品计量要准确，稀释倍数也要准确（1mL 吸管不允许将管口敲掉），进行 100 倍稀释时，1mL 吸管要伸入盐水中，不可以将样品从管壁流下去，同时要避免将管底部捅破。
   （8）盐水温度以 40℃左右为宜，不能过热，会将部分微生物烫死；也不能温度太低，不能将样品溶解完全。
   （9）进行稀释时，要摇匀，保证溶液的均一性。
   （10）倾倒平皿时，要注意培养基瓶口不要接触到平皿；倾倒的培养基要适量，不可以太少，在培养过程中易干掉，微生物亦死亡，以 15mL 左右为宜。
   （11）做大肠菌群样时，要提前将乳糖胆盐培养基培养管按需要量备好，放入超净台对外表面进行紫外线灭菌。
   （12）接二步时，要注意先将接种针（环）进行冷却，避免出现接不上菌落的情况，导致无法判断、确认。
   （13）检测完毕，及时放入相应培养箱​进行培养，并清理清洁超净台。
微生物的培养

1.在培养过程中，要随时监控培养箱温度，保证其在适宜的温度进行培养。
2.要按照《微生物检验规范》要求及时观察结果，出现异常，要及时分析原因进行反馈。
思考与讨论

微生物的生长不同于其他生物的生长，微生物的个体生长在科研上有一定困难，通常情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的，因此，微生物的生长通常指群体的扩增。
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