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蛋白定量测定是实验生物学中一种常用的技术,用于测量样品中蛋白质的浓度或总量。这种测定对于生物化学、分子生物学、医学研究等领域非常重要。
图1. 定量蛋白组分析
一、蛋白定量的基本流程包括
1、样品制备:细胞提取物、组织样品、血清、血浆、尿液或其他包含蛋白质的生物样品。确保样品是干净的,没有杂质。
2、选择测定方法:选择适合你的实验需求的蛋白定量方法。
3、制备标准曲线:制备一系列已知浓度的标准样品,需要标准曲线来测定蛋白质浓度。
4、测定样品:将样品与测定方法中的试剂混合,按照方法要求的步骤进行反应。根据反应产物的颜色、吸光度或其他特性,使用分光光度计或其他相关仪器测量并记录结果。
5、计算蛋白质浓度:根据标准曲线或测定方法的公式,计算出样品中的蛋白质浓度。
二、蛋白定量的常见方法包括
1、Bradford 蛋白质测定法
(1)原理:这种方法基于柯马斯亮蓝G-250染料与蛋白质结合时所发生的颜色变化。
(2)优点:操作简单,灵敏度较高。
(3)缺点:受到洗涤剂和其他化学物质的干扰。
2、Lowry 法
(1)原理:基于铜离子在碱性条件下与蛋白质中的多肽键结合,并进一步与Folin-Ciocalteu试剂反应产生颜色变化。
(2)优点:适用于较低浓度的蛋白质。
(3)缺点:步骤比Bradford法更复杂,且易受其他物质的干扰。
3、BCA法(双缩脲酸法)
(1)原理:与Lowry 法类似,但使用BCA试剂,对铜离子和蛋白质反应更为敏感。
(2)优点:适用于微量蛋白质的测定,稳定性好。
(3)缺点:需要较长的孵育时间。
4、紫外吸收光谱法
(1)原理:蛋白质中的色氨酸和酪氨酸在紫外光下有特定的吸收峰。
(2)优点:快速且不需要添加任何试剂。
(3)缺点:对其他物质的吸收干扰敏感,需要较纯净的样品。
5、基于质谱技术的蛋白定量
(1)无标记定量
· 原理:不使用化学标签,直接通过分析肽段离子的强度或计数来定量蛋白质。
· 优点:操作简化,适用于广泛的样品类型,无需额外的化学修饰。
· 缺点:对样品制备和质谱操作的质量要求高,数据处理和解释较为复杂。
(2)iTRAQ/TMT
· 原理:使用特殊的化学标签对样品中的蛋白质进行标记。在质谱中,标记产生特定的裂解离子,用于定量分析。
· 优点:可以同时分析多个样本,提高了实验的吞吐量。
· 缺点:高成本,数据处理复杂,对实验设计和执行有较高要求。
(3)同位素编码亲和标记(ICAT)
· 原理:使用含有不同同位素的化学标签对蛋白质或肽段进行标记,然后利用质谱分析比较不同样本中蛋白质的相对丰度。
· 优点:提供了准确的蛋白质相对量比较,可用于复杂样品。
· 缺点:成本较高,操作复杂,可能无法检测未标记的蛋白质。
(4)SWATH-MS
· 原理:基于数据独立采集,通过系统地扫描所有预定质量窗口来收集质谱数据。
· 优点:提供高通量、高重复性的定量信息,适合复杂样品分析。
· 缺点:需要高级的数据处理技术,对仪器性能要求高。
(5)多重反应监测(MRM)
· 原理:选择特定的前体离子和产物离子对,用于定量特定肽段或蛋白质。
· 优点:高度特异性,灵敏度高,适合低丰度目标蛋白的定量。
· 缺点:每次只能定量有限数量的目标蛋白,需要事先知道目标蛋白的信息。
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