生物研究生qpcr实验求助?

John

为什么跟师姐扩增一样的组织样本，扩增一样的基因，师姐做出来actin的ct为16，我做的在18.19。虽然师姐跟我做的actin和目的基因的ct差值都在5左右，为什么我的都要高一点呢? 实在是找不到问题在哪呀，希望得到大家的帮助

原文地址：https://www.zhihu.com/question/711040647

卡卡

qPCR实验中actin CT值出现差异的原因有很多，即使是使用相同的样本和引物，不同人操作也可能导致结果有所不同。你遇到的情况很常见，不用太担心，可以从以下几个方面逐一排查：
1. RNA提取和cDNA合成:

• RNA质量: 你的RNA提取质量可能不如师姐的，导致cDNA合成效率较低。
  
  
  
  • 检查RNA完整性：使用琼脂糖凝胶电泳或Agilent 2100 Bioanalyzer评估RNA的完整性，确保28S和18S rRNA条带清晰，且28S rRNA亮度约为18S rRNA的两倍。
    
  • 检查RNA纯度：使用NanoDrop等仪器测定RNA的A260/A280和A260/A230的值，确保RNA没有蛋白质、酚类或其他污染物的残留。
    
  
  

• cDNA合成效率:  cDNA合成过程中，试剂的质量、操作手法、反应条件等都可能影响cDNA的产量和质量。
  
  
  
  • 检查反转录酶和引物的质量：确保使用高质量的反转录酶和引物，并正确储存和使用。
    
  • 优化反转录反应条件：根据所用试剂盒的说明书，优化反转录反应温度、时间等参数。
    
  • 使用相同批次的试剂：尽量使用与师姐相同批次的试剂，以减少批次间差异的影响。
    
  
  

2. qPCR反应体系和操作:

• 加样准确性:  qPCR反应体系的加样量非常微小，任何误差都可能导致CT值的变化。
  
  
  
  • 使用校准过的移液器：确保使用校准过的移液器，并进行规范的操作。
    
  • 避免气泡：加样过程中避免产生气泡，气泡会影响反应体积的准确性。
    
  • 混匀充分：确保反应体系充分混匀，避免试剂分布不均。
    
  
  

• 反应条件: 反应条件的细微差异也可能导致CT值的变化。
  
  
  
  • 检查PCR仪的性能：确保PCR仪的温度控制准确，并进行定期校准。
    
  • 优化反应程序：根据所用试剂盒和引物的说明书，优化退火温度、延伸时间等参数。
    
  
  
• 试剂质量:  qPCR试剂的质量对实验结果至关重要。
  
  
  
  • 使用高质量的试剂：确保使用高质量的qPCR试剂，并正确储存和使用。
    
  • 避免试剂污染：避免试剂受到污染，例如使用无菌的枪头和离心管。
    
  
  

3. 数据分析:

• 基线和阈值的设置:  基线和阈值的设置会影响CT值的计算。
  
  
  
  • 正确设置基线和阈值：根据扩增曲线，选择合适的基线和阈值。
    
  • 使用自动基线和阈值设置功能：如果软件有自动基线和阈值设置功能，可以尝试使用。
    
  
  

4. 其他因素:

• 移液器校准: 确保你使用的移液器与师姐使用的是同一台或经过校准，移液器的误差会导致加样量不准确。
  
• 耗材:  不同品牌的耗材也可能对qPCR反应有细微影响，尽量使用与师姐相同的耗材。
  
• 操作习惯:  每个人的操作习惯不同，例如混匀手法、离心力度等，都可能对实验结果产生影响。
  

建议:

• 与师姐详细交流:  详细了解师姐的实验步骤和操作细节，并观察她的操作过程，找出可能存在的差异。
  
• 重复实验:  重复进行几次实验，观察CT值的稳定性，排除偶然因素的影响。
  
• 设置平行样:  每次实验设置多个平行样，可以减少误差，提高实验结果的可靠性。
  
• 优化实验条件:  如果以上方法都不能解决问题，可以尝试优化实验条件，例如RNA提取方法、cDNA合成试剂盒、qPCR试剂盒、反应程序等。
  

希望以上建议能帮助你找到问题所在，祝你实验顺利！

继续前进

除了上面小伙伴提到的反转录体系、cDNA稀释比例、actin引物、qPCR体系，

• 你是自己提了一批组织样本RNA嘛？如果是的话，提完RNA之后测了浓度吗？反转录的时候是否将RNA稀释到同一浓度或者反转录取的RNA的ng数和师姐一致嘛（也就是最后cDNA浓度是否是一致的）？
  
• 你们用的荧光定量仪器是同一台嘛？（同一品牌不同台的仪器也是有可能出现较大差异的）
  
• cDNA的稀释手法是一样的吗？（比如说，梯度稀释至2倍，2倍稀释至4倍，4倍稀释至8倍，和直接稀释至8倍，理论应该是一样的但实际上依旧是会有偏差的）
  
• 如果体系都是一致的，引物也一样，配置的浓度也一样，那可能考虑下你们试剂是否有更换过，如果未更换，是否可能是试剂的批次问题。
  
• 最最后，其实超纯水如果水质不过关的话可能对这个也会有影响（不过这个出问题的情况少）。
  

如果可以的话，在一块板上（也就是在同一块板上、用同样的试剂和体系、用一个人操作、在同一个机子上跑），拿师姐的cDNA样本和自己的cDNA样本，用同样的条件扩一下。如果师姐的样扩出来ct依旧16，你的18，那可能反转录成cDNA的时候就有差异了。

感恩由您

反转录体系一样吗？
反转录后cDNA的稀释比例一样吗？
actin的引物一样吗？
qPCR的体系一样吗？
手抖不会有这么大差距