RNA提取+RT PCR实验

莺歌燕舞

RNA提取

1. 收集目的菌体；
2. 研钵置于180℃烘箱3小时，备用；
3. 采用液氮低温研磨15分钟至菌体破碎，可通过镜检查看菌体破碎效果，该过程避免破碎时间过久；
4. 吸取1 mL Trizol，充分混匀后转移至RNase free的EP管中；
5. 在每管样品中加入200 μL氯仿，剧烈振荡15 s后，室温放置2 min；
6. 12000 rpm，4°C离心10 min，吸取350 μL上清液到新的RNase free EP管；
7. 加入350 μL 70% 的无水乙醇，吹打混匀；
8. 将上述700 μL混合液转移至吸附柱中，12000 rpm离心30 s，弃废液；
9. 吸取700 μL的RW1到吸附柱中, 12000 rpm离心30 s，弃废液吸取500 μL 的RW2到吸附柱中, 12000 rpm离心30 s，弃废液；
10. 重复步骤9；
11. 12000 rpm离心2 min后，把吸附柱转移到新的EP管；
12. 开盖后，室温放置5 min晾干；
13. 在吸附柱中添加60 μL RNase free的水，静置1分钟；
14. 12000 rpm，4℃离心1 min，将含有RNA溶液的EP管迅速置于冰上，防止降解；
取出5 μL的RNA溶液，用于后续的浓度测定以及质量检测，余下的RNA溶液在-80°C冰箱中保存，备用。
qRT-PCR 分析
（1） gDNA的去除
  采用天根公司的FastQuant RT Kit (with gDNase) 试剂盒去除RNA样品中的gDNA，具体步骤如下:
  1. 将已提取的RNA样品置于冰上10 min解冻；
  2. 取出试剂盒中的10×Fast RT Buffer、5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、RNase-Free ddH2O于室温解冻，并置于冰上；
  3. 按照表1配制反应体系，混匀；
  4. 42℃孵育3 min后置于冰上；
  5. 取出1 μL混合液作为模板通过PCR检测gDNA是否去除干净；
  表1：gDNA去除体系

组分	体积
5×gDNA Buffer	4 μL
RNA	1μL (2   μg)
RNase-Free   ddH2O	15 μL

（2）cDNA的合成
采用天根公司的FastQuant RT Kit (with gDNase) 试剂盒合成cDNA，具体步骤如下:
1. 逆转录的反应体系见表2，按照该体系配置混合液；
2. 将上述混合液与已去除gDNA的RNA样品等体积混匀；
3. 42℃孵育15 min；
4. 95℃孵育3 min后置于冰上，cDNA的合成完成。
表2 逆转录反应体系

组分	体积
10×Fast RT Buffer	2 μL
RT Enzyme Mix	1 μL
FQ-RT   Primer Mix	2 μL
RNase-Free   ddH2O	5 μL

（3）实时荧光定量PCR
  使用KAPA BIOSYSTEMS公司的试剂盒进行实时荧光定量PCR实验，具体操作如下：
  1. 按表3配制反应体系，并混匀，注意避光；
  表3qPCR反应体系

组分	体积（μL）
2 X   KAPA SYBR mix	10
Forward   primer (5 μM)	0.8
Reverse   primer (5 μM)	0.8
模板（反转录的RNA样品）	2

  2. 放置于RT-qPCR仪中进行实验，反应程序如下：
  步骤1，95℃ , 1 min，
  步骤2，95℃,15 sec，
  步骤3，58℃, 30 sec，
  步骤4，72℃, 30 sec，
  步骤5，步骤 2到4, 循环39次
  步骤6，扩增循环结束后，降温至60℃，加热升温至95℃
  3. 拷贝数据后，采用2-ΔΔCt法进行相对定量数据分析：
  ΔCt = Ct (Target) – Ct (TEF1);
  - ΔΔCt = - [ΔCt (Sample) - ΔCt (Control)]
  Fold change=2-ΔΔCt

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/637627710