一文读懂！Seahorse数据统计分析——OCR、ECAR

虎威将军

一、基本原理

Seahorse能量代谢分析仪是一种用于测量细胞能量代谢的仪器，可以通过测量细胞的耗氧率（OCR）和胞外酸化率（ECAR）来评估细胞的线粒体功能、糖酵解和氧化磷酸化等过程。OCR和ECAR的测量原理如下（图1.1）：
OCR（Oxygen Consumption Rate）：OCR是指细胞对氧气的消耗速率。Seahorse能量代谢分析仪通过测量细胞周围培养基中的溶解氧含量的变化来确定OCR。在测量过程中，细胞被置于特定的耗氧试剂中，如噻唑类化合物（例如，琥珀酸、马拉酸和氰化钠）。这些试剂会与细胞内的线粒体呼吸链相互作用，导致氧气消耗速率的变化。Seahorse能量代谢分析仪通过测量耗氧试剂与细胞周围培养基中溶解氧含量的变化，计算细胞的OCR。
ECAR（Extracellular Acidification Rate）：ECAR是指细胞外酸化速率，也可以理解为细胞产生的酸性代谢产物的释放速率。Seahorse能量代谢分析仪通过测量培养基中pH值的变化来确定ECAR。在测量过程中，细胞被置于特定的酸化试剂中，如葡萄糖和丙酮酸盐。这些试剂会导致细胞糖酵解过程中乳酸的产生，从而引起培养基pH值的变化。Seahorse能量代谢分析仪通过测量培养基中pH值的变化，计算细胞的ECAR。



图 1.1 （来源：http://lwldevelopment.com/newsinfo/1611759.html）

1、OCR（图1.2）

（A）基础呼吸（Basal respiration）：用于满足细胞的 ATP 需求和质子漏的耗氧。代表细胞在基础状态下的能量需求。
（B）第一次加药——寡霉素（Oligomycin）：是一种抑制线粒体ATP合酶，即抑制呼吸链上的线粒体复合物V。该药可以影响或降低通过ETC的电子流。加入oligo之后OCR从基础呼吸降低的部分即为氧化磷酸化的耗氧率（ATP production）。

此时余下的部分则是质子渗漏造成的耗氧率。线粒体质子漏（Proton Leak）是指在线粒体内质膜上存在的一种通透性蛋白通道，允许质子从线粒体内腔返回细胞质，从而绕过线粒体ATP合酶（ATP synthase）。正常情况下，质子在线粒体内膜上形成质子梯度，通过ATP合酶驱动ADP和磷酸转化为ATP。然而，质子漏会导致质子梯度的损失，减少ATP的产生效率。
质子漏可以通过调节线粒体内膜上的蛋白通道来发生。一个重要的质子漏通道是线粒体内膜上的UCP（uncoupling protein）家族蛋白。UCP通道可以被激活，使质子通过线粒体内膜，而不经过ATP合酶。这样一来，质子梯度的能量将被释放为热量，而不是用于ATP合成。质子漏的发生可以增加线粒体呼吸过程中产生的热量，并影响细胞能量代谢和体温调节。
质子漏可作为线粒体损伤的标志，也可被认为是调节线粒体ATP合成的一种机制。

（C）第一次加药后下降——ATP合成（ATP production, ATP-linked respiration）：加入oligomycin后产生的耗氧下降部分，占基础呼吸耗氧的一部分，用于驱动ATP合成。代表线粒体满足细胞能量需求的ATP合成能力。
（D）第二次加药——FCCP：是一种线粒体解偶联剂，加入该药会破坏质子梯度和线粒体膜电位，引起电子在 ETC不受限制地传递，同时复合物Ⅳ的耗氧达到最大。FCCP 刺激的 OCR可被用来计算细胞备用呼吸能力（该值为最大呼吸与基础呼吸的差值），备用呼吸能力代表细胞对能量需求增加或在压力下作出反应的能力。
（E）第二次加药后上升——最大耗氧量（maximal respiration）：加入FCCP后获得的细胞最大耗氧。FCCP通过刺激细胞呼吸链以最大能力工作，来模拟一种生理上的“能量需求”，这引起了底物（糖、脂肪、氨基酸）的快速氧化以应对这种代谢挑战。代表了细胞能够实现的最大呼吸速率。
（F）第三次加药——鱼藤酮（rotenone）& 抗霉素A（antimycin A）：第三次加入的药物，是rotenone和antimycin A的混合物。Rotenone是复合物Ⅰ的抑制剂，antimycin A是复合物Ⅲ的抑制剂。这两种药物可关闭线粒体呼吸，从而能够计算出由线粒体之外活动所驱动的非线粒体呼吸耗氧。
（G）第三次加药后下降：①呼吸潜力（spare respiratory capacity）：最大呼吸减去基础呼吸的耗氧。代表细胞对能量需求的潜在响应能力以及细胞基础呼吸与理论呼吸最大值间的差距，细胞响应需求的能力可作为细胞适应性或灵活性的指标。②non-mitochondrial oxygen consumption： 加入rotenone和antimycin A后仍持续的耗氧，这是由一部分细胞酶继续耗氧产生的。该参数对于精确测量线粒体呼吸功能非常重要。



图 1.2

2、ECAR（图1.3）

（A）第一次加药——Glucose：实验第一次加入的药物是饱和浓度的葡萄糖，细胞通过糖酵解途径利用该葡萄糖并将其分解为 pyruvate，产生 ATP、NADH、水和质子。质子释放入胞外环境引起 ECAR 的迅速升高，这种由葡萄糖诱导的细胞应答被称为细胞在基础条件下的糖酵解能力。
（B）第一次加药后的上升——Glycolysis：葡萄糖转化为丙酮酸的过程，本实验中加入饱和浓度葡萄糖后细胞达到的 ECAR值，反映细胞在基础条件下的糖酵解能力。
（C）第二次加药——Oligomycin：实验第二次加入的药物为oligomycin，其为ATP合酶的抑制剂，可抑制线粒体ATP产生，从而将能量产生转移至糖酵解通路，引起 ECAR 进一步升高，反映了细胞最大的糖酵解能力。
（D）第二次加药后上升——酵解容量（Glycolytic capacity）：加入oligomycin后，细胞达到的最大ECAR值，指oligomycin有效关闭了氧化磷酸化功能后，迫使细胞利用糖酵解达到的最大产生能量的能力。
（E）第三次加药——2-DG（2-deoxy-glucose）：2-DG是最后加入的药物，该药通过竞争性结合糖酵解途径的己糖激酶而抑制糖酵解，引起ECAR降低从而证实实验中ECAR的产生来源于糖酵解途径。
（F）第三次加药后下降：①酵解储备（Glycolytic reserve）：Glycolytic capacity 与 Glycolysis的差值， 反映了细胞满足能量需求的能力，以及糖酵解功能与细胞理论最大值之间的接近程度。②Non-glycolytic acidification：细胞外酸化的其他来源，非来自糖酵解途径。



图 1.3

二、数据筛检

Wave软件为免费下载：安捷伦细胞分析软件 | 安捷伦 (agilent.com.cn)。
成功下载后点击后缀名为.asyr的工程文件，打开。刚开始是一个Quick View的界面，用于大致浏览结果（图 2.1）。



图 2.1

然后点击Add按钮，选择Overview。OCR，ECAR单个浏览（图2.2）。



图 2.2

1、检查实验准确性

（1）细胞密度
首先观察OCR的第三个点的值是否处于20~160之间，过低与过高都表示细胞密度不佳（图2.3）。一般来说OCR值与细胞密度成正比。



图 2.3

（2）背景孔一致性
取消勾选界面偏右上的Background Correction，基线要在±20之间（图2.4-2.5）。在Measurement里面检查每一条的基线（图2.6）。



图 2.4



图 2.5



图 2.6

随后将Y1修改为Level，点击Plate Map处左上小三角，只显示背景孔，并将Display改成Well，则能看到每个孔在试验期间的氧分压（mmHg）。正常背景孔氧分压为140-150mmHg左右（图2.7）。



图 2.7

（3）细胞孔一致性
还原小三角，查看细胞孔压力，其因为细胞的存在，正常压力稍比背景孔小一些。正常应为120-170mmHg。在此过程中，可在右侧Plate Map处手动选择孔道以观察目的组别内或组别间的差异。点击相应孔，该孔颜色会转为灰色，线条随即消失（图2.8-2.9）。右边孔和左侧图的线条是一一对应的，选中其一另外一个也会显示。这对我们判断误差和勾选具有很大的便利。



图 2.8



图 2.9

如果细胞孔的氧气压力大于170mmHg，同时其OCR为负值，则表明该孔有气泡影响实验。
保持上述其他不变，将Rate改为ECAR（图2.10），查看数据的pH值。



图 2.10

同样点击右侧Plate Map的左上角小三角符号，显示背景孔的pH值（图2.11）。背景孔的值应该为7.4，非常准确。



图 2.11

再次点击右侧Plate Map的左上角小三角符号，显示细胞孔情况（图2.12）。由于细胞利用葡萄糖进行无氧糖酵解产生乳酸，因此pH会下降。这里也可以看到误差值较小。



图 2.12

所有检查完毕后即可将Display改为Group，Y1改为Rate，检查分组均值和OCR、ECAR情况（图2.13）。



图 2.13

另，如果ECAR的值，特别是前三个基线点与OCR值的趋势相反，即有比较大的意义，可上图。但很多情况下 可能不会。

2、标准化校正

有些时候，如果最终检测时各孔的细胞密度不一（如原代细胞铺板、两块板子之间、干预处理影响不同组之间的细胞生长），则需要校正（图2.14）。点击Normalize，一般填入Normalization Unit（标准化单位）为10000 cells，Scale Factor默认为1。在每个孔中填入相应的细胞数（除以标准化单位后的）；细胞数可以用胎盘蓝、高内涵（Hochest染色）等进行计数。另一种是用蛋白量来计数，那么标准化单位就可以设为1 ug；然后BCA等方式定量后进行输入。



图 2.14

3、其他指标概览

（1）OCR vs. ECAR
Add图标（图2.15），还有两个选项，一个是OCR vs. ECAR。这个将ECAR作为横坐标，OCR作为纵坐标，生产了一个能量概览图（图2.16）。可以帮助快速的判断组之间的能量代谢状态差异。理论上来讲，各组中心点的横纵坐标乘积大致代表其整体能量消耗，乘积越大能量消耗越高（图2.17）。



图 2.15



图 2.16



图 2.17（来源：http://lwldevelopment.com/newsinfo/1611759.html）

（2）Data
Add图标（图2.15）里面另一个选项为Data。其中展现了实验运行的几乎所有数据，鼓励自行探索。值得一提的是，在Raw项目（图2.18）中包含了一个Well Temperature（孔温度、运行温度）和Env. Temperature（环境温度）。理论上两者越接近越好，相差最好不要超过2℃。
此外，在Event Log项目中包含了板子对应的唯一序列号。



图 2.18

三、统计分析（以OCR为例）

点击Export，一般可选择对应的板块导出（图3.1）：①GraphPad Prism；②Seahorse XF Glycolysis Stress Test Report Generator；③Seahorse XF Cell Mito Stress Test Report Generator。

注意导出的时候须把Background correction勾选回去，同时视情况勾选Normalization。

图 3.1

以OCR为例（③）打开对应导出的Excel，启用宏之后选择需要计算的group，然后点击Update Summary（图3.2）。即可得到总览图（图3.3）和各个部分的细节图（图3.4）。其他部分可自行探索。



图 3.2



图 3.3



图 3.4

但对于此最重要的部分是在Assay Parameter per Well板块，这里会给出各组的每个孔的每一段曲线三次重复测量的均值（图3.5），以供进行统计学比较（t.test，ANOVA等）。此外，根据Assay Parameter per Well中提供的具体指标的最终值（根据各孔的三次测量的均值测算），可以观察是否有空偏移较大（当然也可以通过统计学方法寻找离群点），判断该孔是否可信，如不可信，可舍弃该孔。可根据孔的编号，回寻Wave软件中孔的各项数值，并对应到Graphpad中进行删节。

注意，如果作图，仍然推荐是用①导出的graphpad进行作图（折线图）和统计（柱状图）。

图3.5

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