临床检验微生物实验室工作流程（真菌检验）

John

上一篇写完了细菌检验，这一篇接着写真菌检验。
基本特性：

• 概念：真菌（Fungus）是真核细胞型微生物，具有细胞核和完整的细胞器。
  
• 分类：真菌的种类很多，分鞭毛菌、接合菌、子囊菌、撮子菌和半知菌五类。
  

<hr/>生物学性状：

• 基本结构：
  

• 真菌分为单细胞真菌与多细胞真菌两大类。
  
• 单细胞真菌常见的有酵母型真菌和类酵母型真菌。
  
• 酵母型真菌：不产生菌丝，由母细胞以芽生方式繁殖，菌落柔软、光滑、湿润，呈奶油样，与细菌的菌落形似。
  
• 类酵母菌：有假菌丝，如白假丝酵母菌。在培养基内可见由假菌丝连接形成的假菌丝体。
  
• 多细胞真菌：由菌丝和孢子组成。菌丝伸长分，交织成团，故多细胞真菌也称为丝状菌或霉菌。
  

沙保弱平板——霉菌（丝状）



血平板——酵母型菌落（光滑，奶油样）

• 培养条件：真菌培养最常用的培养基为沙保弱培养基，最适温度在22-28℃，最适PH为5.0-6.0。
  
• 真菌菌落：
  

• 酵母型菌落： 酵母菌以及隐球菌多为此型。
  
• 酵母样菌落：白色念珠菌呈现为此型菌落。
  
• 丝状菌落：菌落呈棉絮状，绒毛状或粉末状。
  

4. 抵抗力：真菌对干燥、阳光、紫外线及一般化学消毒剂有耐受力。对2.5%碘酒，10%福尔马林都敏感。对热敏感，一般60℃1小时可杀死真菌菌丝和孢子。
5. 致病性：真菌引起的疾病大致分为三类，分别是感染，变态反应和真菌毒素中毒。

• 真菌性感染主要是外源性感染，包括浅部真菌和深部真菌感染。浅部真菌有亲嗜表皮角质特性，侵犯皮肤、指甲及须发等组织，顽强繁殖，发生机械刺激损害，同时产生酶及酸等代谢产物，引起炎症反应和细胞病变。深部真菌可侵犯皮下，内脏及脑膜等处，引起慢性肉芽肿及坏死。
  
• 变态反应：过敏性真菌病系在各种过敏性或变态反应性疾病中，由真菌性过敏原（如孢子抗原）引起过敏症，如哮喘，变态反应性肺泡炎和癣菌疹等。
  
• 真菌毒素中毒：真菌毒素已发现100多种，可侵害肝、肾、脑、中枢神经系统及造血组织。如黄曲霉素可引起肝脏变性，肝细胞坏死及肝硬化，并致肝癌。黄绿青霉素引起中枢神经损害，包括神经组织变性，出血或功能障碍等。某些镰刀菌素和黑葡萄穗素主要引起造血系统损害，发生造血组织坏死或造血机能障碍，引起白细胞减少症等。
  

<hr/>真菌检验：
病原性真菌按其侵犯的部位的不同,分为浅部感染性真菌和深部感染性真菌两大类。因此，两大类真菌的检验将分开描述。
<hr/>浅部真菌检验：
浅部感染性真菌是指引起表面角化组织(如皮肤、毛发、指(趾)甲等)感染的真菌,一般不侵人皮下组织或内脏,寄生或腐生于表皮、毛发和甲板的角质组织中,在临床上可引起浅部真菌病,简称为癣。目前比较公认的对人类有致病作用的浅部感染性真菌可分为皮肤癣菌和角层癣菌两大类,其中皮肤癣菌在临床上最多见。皮肤癣菌又称为皮肤丝状菌,包括毛癣菌属、表皮癣菌属和小孢子癣菌属 40 余种真菌。
我在华西医院微生物实验室轮转时，去过真菌皮肤门诊学习过两个星期。
浅部真菌感染涉及到的部位往往是毛发，皮肤指甲等表面组织。检查方法也很简单——直接镜检。
毛发和皮屑：玻片滴加生理盐水，则可直接采用透明胶带黏贴镜检；
指甲等：则需要用KOH溶液进行消化之后再镜检。
因此，我们可以一起回忆一下。是不是很少在微生物实验室看到有临床送几根头发或者几片指甲来做培养？因为这类标本往往镜检就可以查找到相应的病原菌。而培养往往是深部感染性真菌要做的。
<hr/>深部真菌感染：
深部感染性真菌是指侵犯除皮肤及其附属器官以外的深部组织、内脏以及全身的一类致病性和条件致病性真菌。
常见的有假丝酵母菌、隐球菌、曲霉、毛霉等，其中隐球菌不属于条件致病菌，属于致病菌。
检验流程：培养——观察菌落——转种显色培养基/染色/药敏试验——出报告。
1.真菌培养的常见标本：痰液、肺泡灌洗液、气管分泌液、无菌体液、尿标本、分泌物、病理组织。
【备注：有的标本也会同时送检革兰染色（涂片查真菌）以及墨汁染色（例如脑脊液怀疑隐球菌感染）】
2.真菌培养所用培养基：沙保弱平板。
3.培养条件：22-28℃培养箱。
但标本在完成接种之后，通常不会直接放入28℃培养箱，会在35℃普通培养箱中放一天之后再转入28℃。
真菌的最适生长是22-28℃，那为什么要放入35℃呢？（文末揭晓答案）
4.培养时间：痰液、大便、尿液及分泌物5天、肺泡灌洗液10天、胸腹水等无菌体液10天，皮屑及病理组织28天。脑脊液10天出阴性报告后，标本继续培养至21天。需要做药敏的则在培养阳性后1-2天。
5.观察菌落：
    如果怀疑是假丝酵母菌，则可以转种科玛嘉念珠菌显色培养基，根据颜色变化大致判断菌种。

（备注：念珠菌显色培养基用于白色念珠菌分离和鉴定。念珠菌显色培养基根据酶底物法，通过显色来区别不同念珠菌，25-28℃培养48小时后，白色念球菌显蓝绿色，热带念珠菌显蓝灰色或铁蓝色，光滑念珠菌显紫色，克柔假丝酵母显粉色，其它念珠菌显白色，细菌被抑制。）

念珠菌显色培养基

    如果出现了丝状型菌落，则可以进行乳酸酚棉蓝染色，根据形态判断菌种。


（备注：棉酚蓝染液可使酵母菌细胞、菌丝体和产孢结构等皆可被染成亮蓝色更容易被观察）

（备注：这些方法都只是真菌鉴定的辅助方法，目前能够准确鉴定菌种的方法仍然是质谱仪。）
揭晓答案：有一类真菌叫做二相性真菌，它们的形态可以随着环境的改变而发生变化，例如组织胞浆菌等。35℃时可呈现为酵母型真菌，而在28℃培养时呈现为丝状型菌落。

6.药敏试验：真菌的药敏试验没有细菌药敏试验如此复杂，但是内容也很多，我用几个小问题来简单阐述真菌药敏。

• 一般的实验室会开展真菌药敏吗？——会。
  
• 什么时候需要做药敏？——对于这个问题，每个实验室也不尽相同。我目前所在的实验室对于标本而言：只做无菌体液的真菌药敏试验，比如脑脊液、分泌物等，痰液之类的就不做。对于菌种而言：只做酵母菌，不做丝状菌，后者仅是乳酸酚棉蓝染色。
  
• 采用什么方法？——这个也是不同的，有的是采用梅里埃ABT，有的则是迪尔药敏板。但多数是采用MIC的方法。
  

7.出报告：做完药敏试验就可以出具检验报告了。
以上就是对于真菌检验流程的简单梳理，请大家多多批评指正！

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