Western Blotting之一

二维码

本文为进阶高手提供参考。本文仅述细胞培养之mini gel 之Western blotting。
Western Blotting 技术应包括从细胞培养，细胞裂解，蛋白定量，跑胶，曝光显影和结果分析。
一， 细胞裂解液
假定细胞内是pH中性，更假定你研究的蛋白是在pH中性下最优，那么细胞裂解液需要Tris- HCL或者HEPES来缓冲，也需要盐保持一定的渗透压和蛋白之适宜环境，10%甘油帮助蛋白稳定；破脂质的去污剂NP-40（sigma有个替代品），Triton X-100等不能少了；蛋白酶需要金属离子降解蛋白，故而用EDTA和或EGTA来抓走金属离子；蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂不能少，根据实验目的选择；也要考虑其他的抑制剂，如deubiquiting, desumolyating, dePARYlating 抑制剂等等。所以常用的lysis bufer 以20mM Tris, 120mM NaCL, 0.5-1%NP-40, 1mM EDTA, 10%glycerol 和水为基本而加减。
RIPA buffer 有0.5%SDS，不太适用于co-IP；
介绍一个简单的1%SDS lysis buffer： 1%SDS，20mM Tris HCl, pH 8.0, 2mM MgCl2, 20mM NaCl, 500U/ml benzonase (sigma).室温下裂解，不用蛋白酶抑制剂，不用磷酸酶抑制剂，不用离心，裂解充分，简单迅速，省，省力，省钱。且BCA 蛋白定量试剂盒兼容。
二，测蛋白浓度
用 BCA protein assay, 必须做好标准曲线，拉个f(x)=ax^2+bx+c方程，而不是f(x)=ax+b; 如果样本之间测出来的OD值相差太远，要稀释后重测，使得od值在BCA protein assay 中的BSA可认知的范围内，才能得到样本之间蛋白浓度近似的同一标准，即你的f(x)=ax^2+bx+c方程。否则，蛋白浓度都不准确，样本之间的蛋白量不等，谈何后续的定量比较。
三，煮不煮？
蛋白裂解液和 laemmli buffer (要加DTT或者beta-巯基乙醇）混合后，可以不95C 5 min. 室温下 混匀放一会儿，-80C保存。 此法对于膜蛋白尤为重要。 可查阅国内的优秀公司 ptglab.com 的相关膜蛋白抗体产品说明。
四，跑胶 一般load 10ug total protein, 各个孔内上的样本体积别相差太大，否则you will easily get ugly bands. 可选任意60-80-100-120-200V电压，转膜 0.22uM 的膜，别有气泡哈, 350mM, 1h30min.
五，直接扔进5%去脂奶粉，15分钟以上即可，别有费动作，省时间。
六，一抗稀释：常规CTS的抗体1:1000 in 5%BSA, santacruz 的抗体 1:1000-10,000 in 5%去脂奶粉; 用小塑料袋封住，保证膜浸在抗体中，可以背靠背两个膜，拒绝三个膜，拒绝可能的风险。 一般而言，CTS的抗体能保证成功，但是太贵，用一两次就不太好用了；santacruz 的抗体，量大便宜，抗体滴度高，且可重复用很多次；前提是你得会找：找抗体说明书中有内源蛋白条带的抗体，一般都很好用; 别找没有条带的，或者是外源蛋白条带的抗体。4C 过夜，摇晃。
七，内参 GAPDH，不要怀疑GAPDH，GAPDH就是个好内参，当你实验技术过关了，如果发现GAPDH不是好内参时，恭喜你，你该有大发现了。推荐sc-32233，1:10000，可重复用八九十来次；总蛋白量5-10ug。
八，洗，回收一抗。 用水涮好几次，没错，就是用水，如果自来水质量不好，用单蒸水涮几次，然后放入TBST，洗，10分钟左右，只一次。转入二抗，建议用固定的公司的二抗，固定的稀释；比如用biorad的二抗，1:10000. 30分钟以上，2个小时以内都可以；然后，用水，用水，用水涮涮涮几次，投入TBST，只洗一次， 10分钟-20分钟，足矣，之后，用水，用水，用水涮涮涮。
九，曝光，到暗室，加ECL，30秒到一分钟，放片子，曝光5 秒，20秒，1分钟，15分钟等等。查阅文献及抗体说明书，预估目的蛋白条带之强弱；弱的，就先用最长时间曝光；强的，好办。

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