蛋白免疫印迹（ Western Blot）详细操作步骤

心中u你

原理：
蛋白免疫印迹（ Western Blot，WB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。 WB 是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。本SOP包括Western Blot 操作方法及常见问题分析，有助于成功完成 WB。

一、蛋白样本提取制备
1 细胞或组织裂解
2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂
3 蛋白定量
4 电泳上样样品的准备
二、 电泳
1 PAGE 胶的制备
2 蛋白分子量 Marker
3 阳性对照
4 内参对照
5 上样与电泳
三、 转膜与显色（ Western Blot）
1 胶中蛋白的检测
2 蛋白转膜
3 膜上蛋白的检测：丽春红
4 膜的封闭
5 一抗的孵育
6 二抗的孵育
7 显色
四、常见问题分析与解决方案
五、试剂及缓冲液配方
一、蛋白样本提取制备
蛋白样品制备是 Western Blotting 的第一步，是决定 WB 成败的关键步骤之一。
蛋白提取总体原则与注意事项包括：
1) 尽可能提取完全或降低样本复杂度使得集中于提取目的蛋白（通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）。
2) 保证蛋白处于可以溶解状态（通过裂解液的pH 、盐浓度、 表面活性剂、还原剂等的选择实现）。
3) 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等（全程保证在冰盒中低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）。
4) 尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）。
5) 样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。
1-1 细胞或组织裂解
1-1-1 细胞裂解
1. 培养的细胞经预冷的 PBS 漂洗 2 次；
2. 吸净PBS，加入预冷的裂解液（使用前裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂）(0.1 ml /10６ cells)；结合不同培养板及实际细胞数量级及参照下表加入相应量裂解液：
</td>面积（cm2）细胞量（个）裂解液量（μl）96 孔培养板0.320.4-1.0×10520-5024 孔培养板20.3-0.6×10630-6012 孔培养板4.50.6-1.2×10660-1206  孔培养板9.61.2-2.5×106120-2503.5 cm 培养皿81.0-2.0×106100-2006  cm 培养皿212.5-5.0×106250-50010 cm 培养皿550.7-1.5×107700-150025cm2 培养瓶253.0-6.0×106300-60075cm2 培养瓶751.0-2.0×1071000-2000
3. 用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的离心管中；不能用细胞刮子刮取的情况可直接冰上裂解30min后用枪多次吹打至细胞完全裂解；
4. 4℃摇动 30 min；
5. 4℃离心 12000 rpm，20 min；
6. 轻轻吸取上清，转移至新预冷的离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀。蛋白样本暂时不作处理时可以放入-80℃保存。
7. 目的蛋白非细胞外基质（ECM）或对胰酶不敏感时也可以采用胰酶消化法收集细胞（即细胞吸去培养基，PBS 漂洗 2 次，加入胰酶消化至脱落，加入预冷的PBS，移入预冷的EP管，离心收集细胞，加入预冷裂解液（使用前加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂），依次按上面4，5，6步骤处理。
1-1-2 组织裂解
1. 用预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解；
2. 将组织块放在圆底的微量离心管或 EP管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80°C；
3. 每约10 mg组织加入约200 μl 预冷的裂解液（使用前加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂），冰浴匀浆后置于4℃摇动2h，裂解液体积与组织样本量有适当比例（最终的蛋白浓度至少达到1 mg/ml，理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml).
4. 4℃离心 12000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀。蛋白样本暂时不作处理时可以放入-80℃保存。
1-2蛋白酶抑制剂
本实验室使用的蛋白酶抑制剂为PMSF，抑制丝氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，凝血酶）和巯基蛋白酶（如木瓜蛋白酶）。在水液体溶液中不稳定，30min就会降解一半，应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中。
工作浓度一般用1mM，1:100(V/V)加入贮液（100mM PMSF），样品处理超过1h，补加一次。
PMSF剧毒,为了安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作．PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。
PMSF在水溶液中的活性丧失速率随pH值的升高而加快，且25℃的失活速率高于4℃。pH值为8.0时，20μmmol/l PMSF水溶液的半寿期大约为85min，这表明将PMSF溶液调节为碱性（pH>8.6）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。
除PMSF外，裂解液中还需加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（做磷酸化蛋白时必须加），推荐购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或 COOKTAIL，或按下表配制：
备注：其中Sodium orthovanadate 配制活化方法如下：所有步聚均需在通风橱中进行：
1）. 用双蒸水配制100 mM 正矾酸钠溶液；2）. 用盐酸HCl 调至pH 9.0；3）. 煮沸至溶液无色,尽量减少水分挥发；4）. 冷却至室温；5）. 再调pH 至 9.0；6）. 再煮沸至无色；7）. 重复上述过程，直至溶液煮沸冷却后达pH 9.0；8）. 用水定容至原体积；9）. 分装保存于- 20°C. 溶液变黄则弃之不用。


1-3 蛋白定量
BCA 法以牛血清白蛋白 (BSA) 作为标准曲线。基于双缩脲原理，碱性条件下蛋白质将 Cu2+ 还原成 Cu1+， BCA（Bicinchoninic 酸）螯合 Cu1+ 作为显色剂，产生兰紫色并在 562 nm 有吸收峰，单价 Cu1+ 与蛋白呈剂量相关性，灵敏性很高，试管法可测范围 20-2000 μg/ml，微孔法为 0.5-10μg/ml。不易受一般浓度去污剂的干扰。可耐受螯合剂、略高浓度的还原剂的影响，40min内抗干扰能力强。
BCA测定方法如下：
1) 标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂：

孔号01234567蛋白标准溶液（μL）01234567去离子水（μL）2019181716151413对应蛋白含量（μg）05101520253035

2) 根据样品数量，按 50 体积 BCA 试剂 A 加 1 体积 BCA 试剂 B（50:1）配制适量 BCA 工作液，充分混匀；
3) 各孔加入 200μL BCA 工作液；
4) 把酶标板放在振荡器上振荡 30sec，37℃放置 30 min，然后在 562nm 下比色测定。以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；
5) 稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为 20μL，加入 BCA 工作液 200μL，充分混匀，37℃放置 30 min后，以标准曲线 0 号管做参比，在 562nm 波长下比色，记录吸光值；
6) 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释液总体积（20μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：μg/μL）。
1-4  电泳上样样品的准备
1-4-1变性、还原蛋白样本
一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部份序列结构（表位），因此，为使抗体能够达到结合该表位而需要将蛋白样本进行变性，使之打开折叠的空间结构，蛋白变性一般使用含阳离子变性去污剂如 SDS 的上样 buffer （loading buffer），并于 95-100°C 煮沸5 min，对于多次跨膜蛋白，可以于 70°C 加热 5-10 min，本实验室的 上样 buffer 称为5×SDS凝胶还原型加样缓冲液，上样时与样本1：4混合后变性上样即可。
SDS是阴离子去污剂、变性剂。氨基酸侧链与 SDS 充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束，蛋白质-SDS 胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异，SDS与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。
1-4-2  天然和非还原样本
某些抗体识别的表位是非连续氨基酸构成的蛋白三维结构，此种情况则需要进行非变性的 WB，抗体的说明书一般会标注，这种非变性电泳不加 SDS，样本也不需煮沸。某些抗体仅识别蛋白的非还原态，如某些 cysteine 基的氧化态，即loading buffer 和电泳液中不加入β-巯基乙醇和或DTT。

data-draft-type=&#34;table&#34; data-size=&#34;normal&#34; data-row-style=&#34;normal&#34;>蛋白状态凝胶状态loading buffer电泳缓冲液还原—变性还原和变性有β-巯基乙醇或DTT ，有SDS有 SDS还原—天然还原和非变性有β-巯基乙醇或DTT ，无 SDS无 SDS氧化-变性非还原和变性无β-巯基乙醇或DTT ，有 SDS有 SDS氧化-还原非还原和天然无β-巯基乙醇或DTT ，无 SDS无 SDS

注：除说明书特别标注之外，一般情况下，均使用变性和还原电泳
二、 电泳
SDS-PAGE基本原理：
1）. SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入 SDS 和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS 是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
2）. 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与 SDS 充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物。
3）. 蛋白质分子结合 SDS 阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。
2-1 PAGE胶的制备
聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰胺（acrylamide，简称 Acr）和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，简称 Bis）在催化剂（过硫酸胺或核黄素 AP）和加速剂（四甲基乙二胺 TEMED）作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度。是良好的电泳介质。
聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基的催化，使体系发生氧化还原作用来完成的。催化体系主要有化学催化（AP-TEMED）和光化学催化（核黄素-TMTED）体系。
PAGE胶分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电泳体系中缓冲液 pH 值与凝胶中的相同。带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
不连续电泳

作用缓冲液 PH凝胶浓度浓缩胶使蛋白样品浓缩pH6.8 Tris-HCl低，2-5%分离胶使蛋白样品分离pH8.8 Tris-HCl高，根据蛋白大小

不连续系统的浓缩效应：
凝胶层的不连续性：浓缩胶的孔径大，分离胶的孔径小。在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中遇到的阻力小，移动快。而在小孔胶中遇到的阻力大，移动慢。因此，在两层凝胶的交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。
缓冲液离子成分和pH的不连续性：HCl易解离出Cl- ，它在电场中迁移率大，走在最前面，故称为快离子或前导离子。电极缓冲液中的甘氨酸在pH6.8 的缓冲液中解离度很小，仅为 0.1-1%，因而在电场中迁移率很小，称为慢离子或尾随离子。蛋白质均带负电荷，在电场中均移向正极，其有效迁移率介于快慢离 子之间，于是蛋白质就在快慢离子间形成的界面处，被浓缩成极窄的区带。当进入pH8.8的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质，因此氯离子和甘氨酸离子沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留在后面，然后分离成多个区带。根据SDS聚丙烯酰胺的有效分离范围选择分离胶浓度。
SDS-PAGE胶有效分离范围
聚丙烯酰胺胶浓度%线性分离范围/kDa557-2127.536-941020-801212-601510-43
分离胶的配置：将二块玻璃板叠放整齐，用夹子两边夹好，将这二块玻璃板固定在底座上。插入配套梳子，在梳子下缘划线，指示灌胶位置，拔去梳子。在分离胶的配置烧杯中按配方加料，混匀后利用移液器将分离胶(避免气泡产生)滴入二块玻璃板之间，至液面达到梳子下缘1cm 处。用移液器缓慢加入饱和正丁醇或水，注意不要冲乱胶面。静置，待分离胶聚合后，倒去或用滤纸吸去水层。
浓缩胶的配制：在浓缩胶的配置烧杯中按配比加料，混匀后即刻用移液器加浓缩胶(避免气泡产生)覆于二块玻璃板之间的分离胶之上至满，轻轻插入梳子（插入梳子时一边倾斜直至全部插入，防止产生气泡）。静置待其凝结后，即制成凝胶板。
凝胶制成后最少需放置2h或最好湿盒过夜后才能使用，保证交联反应完全。
2-2 蛋白分子量 Marker
预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪。
2-3阳性对照
目的蛋白或明确表达目的蛋白的组织或细胞的蛋白提取物，用于检验整个实验体系和过程的正确性有效性、特别是一抗的质量和效率。建议使用对照，可查阅文献或抗体说明书选择购买或自提对照样本。
2-4 内参对照
管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，用于检测整个 WB 实验过程及体系是否正常工作，并作为半定量检测目的蛋白表达量的标准对照必须设立。

内参名称分子量大小适用范围β-actin43kDa胞浆和全细胞GAPDH30-40 kDa胞浆和全细胞Tubulin55 kDa胞浆和全细胞VCDA1/Porin31 kDa线粒体COXIV16 kDa线粒体Lanin B166 kDa细胞核（不适于去除核膜的样本）TBP38 kDa细胞核（不适于去除DNA的样本）

2-5上样电泳
蛋白抗原上样量为30 ug。根据样品量选择SDS-PAGE电泳玻璃板间隙厚度，一般0.75mm间隙15孔的上样量 < 15uL/孔，1mm间隙10孔的上样量 < 30ul/孔。
上样：将二块玻璃板制成的凝胶板子上的夹子卸去，将凝胶板垂直靠在电泳槽里的电源架上，使凝胶板的凹沿面靠向电源架。通常两块凝胶板共用一个电源架。将凝胶板与电源架按要求固定于电源槽内。按要求加入电泳缓冲液，使分别加入在两块凝胶板中间电源架内的电泳缓冲液与加入在电泳槽中的电泳缓冲液互不相通。轻轻地拔去凝胶板内的梳子。取处理后的样品液，用微量进样器吸取适量样品液，将样品液缓缓加入凝胶板内地凹口部位(样品点入处)。注意不要冲散样品。
电泳：用二根导线连接电泳槽与电泳仪，注意红色与黑色电极的插头和插口相配。电泳时上层胶使用低电压恒压电泳，打开电源将将电压调到80v（一般15min左右），而在溴酚蓝进入下层胶时使用高压恒压电泳，将电压调到120v至溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳。
三、 转膜与显色
3-1胶中蛋白的检测
电泳后检测蛋白是否迁移正确与平均，可采用锌染（负染）、胶染（blue silver）或考马斯蓝染色检测，如果凝胶中的蛋白需要进行转膜则需可逆的锌染法，否则可以采用不可逆考马斯亮蓝法染色。
锌染法（负染）：电泳胶用蒸馏水洗30秒，加入含0.1% SDS 的0.2 M 咪唑溶液摇动染色 10-15 min，再用去离子水洗数秒，加入0.2 M ZnSO4溶液摇动直至在暗背景下蛋白出现透明条带（约1min），移去ZnSO4溶液加入去离子水中止显色；胶置于0.1- 0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0 缓冲液中漂洗脱色两次，再置于电转缓冲液中开始转膜。
胶染（blue silver）法：电泳胶用蒸馏水洗数30秒，考马斯亮蓝G-250染液室温染色1h至过夜，保持摇匀，回收染液，倒入数次去离子水摇动至脱去多余的染料，蛋白被染成深蓝色。
考马斯亮蓝R250法：电泳胶用蒸馏水洗数30秒，考马斯亮蓝R-250染液室温染色1h至过夜，保持摇匀，回收染液，用蒸馏水洗数分钟，倒入脱色液摇匀至脱去多余的染料，蛋白被染成深蓝色。
考马斯亮蓝快速染色脱色方法：  a. 电泳结束后，取胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。通常对于胶浓度大于10％的胶比较坚韧，在发生煮沸时不易破损；对于胶浓度小于10%的胶，宜尽量避免煮沸，以免出现 胶碎裂的情况。  b. 随后在染色液温度较高的情况下，在室温摇床上摇动5-10分钟。 c. 回收染色液。d. 加入适量脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。e. 微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。  f. 随后在脱色液温度较高的情况下，在摇床上摇动5-10分钟。此时通常可以观察到比较清楚的蛋白条带。 g. 更换新鲜的脱色液，重复步骤e和步骤f，直至蓝色背景基本上全部被脱去，蛋白条带染色效果达到预期。  h. 完成脱色后，可以把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。如需避免溶涨，可以把胶保存在含20%甘油的水中。长期保存可以制备干胶。
3-2 蛋白转膜
杂交膜的选择是决定 Western blot 成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于 Western blot 的膜主要有两种：硝酸纤维素膜（NC） 和PVDF 膜。膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用 0.45μm 和 0.2μm 两种规格的膜。大于20kD 的蛋白可用 0.45μm 的膜，小于20kD 的蛋白就要用 0.2μm 的膜了，如用 0.45μm 的膜就会发生“Blowthrough”的现象。最常用于 Western Blot 的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose, NC）膜和聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE 纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和 NC 膜的特点相似，主要用于核酸杂交。
硝酸纤维素（nitrocellulose, NC）膜：NC 与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小；非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便。但结合在 NC 上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失； NC膜韧性较差，易损坏。
聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜：与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合，非常适合于低分子量蛋白的检测。但 PVDF 膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和 1-5 秒钟。
膜的选择主要根据：
1. 膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；
2. 不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；
3. 如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。
蛋白因结合 SDS 而带电荷，在电场下从胶中转至膜上，转膜方式分为半干和湿转两种，半干式转膜速度快，而湿式成功率高并特别适合用于分子量大于100KD  的蛋白。
湿式转膜三明治排列为：海绵/滤纸/ 胶/ 膜/滤纸/ 海绵，全部紧密排列，特别是胶/膜之间不能留有气泡，三明治安放的方向确认正确，负极方为带负电的胶里的蛋白，向正极方（膜）电迁移。SDS-PAGE电泳完毕，用刀片或薄板将凝胶板的两块玻璃轻轻撬开，使凝胶倾伏在其中一块玻璃板上。用刀片在凝胶上沿分离胶与浓缩胶的交界处，将分离胶切下，并在分离胶的左上角切掉一小角，以标记样品顺序。然后将胶小心移入转膜缓冲液中。剪下与分离胶同样大小的0.45um的PVDF膜，以甲醇浸泡5s。剪下6张同样大小的滤纸，与PVDF膜，胶同时以转移缓冲液平衡15min。在转膜装置上从负极（黑底）到正极放置海绵垫片、滤纸、胶、膜、滤纸、海绵垫片（由下而上），放置时一定要排除气泡，特别是膜与滤纸、胶与膜、滤纸与胶之间。设置转膜电流为恒流，200mA，时间约需40min（蛋白大小不同所需时间不同，一般1KD约为1min）。转完后，取出膜，在与胶相同的位置小心剪去一角，标示电泳方向及吸附有蛋白的膜面。
标准的电转缓冲液为 1X Tris-glycine buffer 不含 SDS，但加入 20%甲醇，如果转膜的蛋白分子量大于80KD，则推荐加入 SDS 使之终浓度为 0.1%。PVDF 膜需要浸泡甲醇中 1-2 min，再孵育于冰冷的电转缓冲液中 5 min，胶也需在冰冷的电转缓冲液中平衡 3-5 min，否则转膜时会导致条带变形。
电转移缓冲液中 SDS 与甲醇的平衡、蛋白的大小、胶的浓度都会影响转膜效果，如下调整可以增加转膜效率：
a) 大蛋白（大于 100 KD ）
1) 对于大蛋白而言，其在凝胶电泳分离迁移较慢，而从凝胶转出也非常慢，因此对于这种大分子量蛋白应该用低浓度的凝胶， 8% 或更低，但因低浓度的胶非常易碎，所以操作时需十分小心，
2) 大蛋白易在凝胶里形成聚集沉淀，因此，转膜时在电转移缓冲液加入终浓度为 0.1%的 SDS，以避免出现这种情况，甲醇易使SDS  从蛋白上脱失，因此应降低电转移缓冲液中甲醇的浓度至 10%或更低，以防止蛋白沉淀。
3) 降低电转移缓冲液中甲醇的比例以促进凝胶的膨胀，易于大蛋白的转出。
4) 如果使用硝酸纤维素膜，甲醇是必需的，但如果是 PVDF 膜，甲醇可以不必加入电转移缓冲液中，但转膜前PVDF  需用甲醇活化。
5) 选择湿式， 4℃ 转膜过夜，以取代半干式转膜。
b) 小蛋白（小于 20 KD）
1) SDS 妨碍蛋白与膜的结合，特别是对小蛋白更是如此，因此，对于小分子的蛋白，电转移缓冲液中可以不加 SDS 。
2) 保持 20% 的甲醇浓度。
注意事项：
1. 避免直接接触膜，应使用镊子，手指上的油脂与蛋白会封闭转膜效率并易产生背景污斑
2. 排列三明治时，尽量用移液器或 15 ml 试管赶除胶与膜之间的气泡，或将三明治放在装有的培养皿中以防止气泡产生，请戴手套！
3. 确认裁剪的膜和滤纸与凝胶尺寸相同，否刚导致电流不能通过膜，从而转膜无效
4. 鸡抗体易于与 PVDF 膜和其它尼龙膜结合，导致高背景，请替换成硝酸纤维素膜以降低背景。
3-3  膜上蛋白的检测：丽春红染色
为检测转膜是否成功，无预染蛋白Marker时可用丽春红染色。
染色方法：
将膜放入 TBST 洗一次，再置于丽春红染色工作液中,在室温下摇动染色 5 min，大量的水洗膜直至水变清无色蛋白条带清晰，（膜也可以用 TBST 或水重新洗后再进行染色）PVDF 膜需用甲醇再活化后用 TBST洗后进行封闭。
3-4  膜的封闭
杂交膜上有很多非特异性的蛋白质结合位点，为防止这些位点与抗体结合引起非特异的染色和背景，一般用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点来降低抗体的非特异性结合。封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。最常见的封闭剂是 BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶和 Tween-20（0.05 - 0.1%）稀溶液 PBST 或者 TBST。
Tween-20 的作用：Tween-20 是一种非离子型去污剂，有复性抗原的作用，可提高特异性的识别能力。在做 westen blot 时，用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点可以降低抗体的非特异性结合。Tween 这种非离子型去污剂在乳化蛋白时，不破坏蛋白的结构，可减少对蛋白质之间原有的相互作用的破坏。离子型去污剂如 SDS 则破坏蛋白的结构。
传统上有两种封闭液：脱脂奶粉或 BSA。脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记的抗体一起使用，因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素。如果封闭剂中含磷酸酶，用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白受到影响，因为磷酸酶与印记膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化。检测磷酸化抗体时，不能使用酪蛋白/脱脂奶粉作为封闭剂。某些抗体用 BSA 封闭时因不明原因可能会产生比脱脂奶粉更强的信号，请仔细阅读说明书注明的注意事项和膜的特殊的封闭方法。
一般封闭条件为：5% 脱脂奶粉或 BSA 溶液室温或者 37℃缓慢摇荡 1-2 h，特殊情况也可 4℃过夜。根据结果情况调整封闭试剂的浓度和类型。封闭完成后进行洗膜，在方形保鲜盒中加入TBST，将膜放入其中，使TBST没过PVDF膜，在摇床上低速震荡10min洗1次。
3-5一抗的孵育
孵育 Buffer：按抗体说明书建议的稀释倍数，用封闭液稀释一抗，如果说明书没有建议的稀释倍数，则参照一般推荐的稀释倍数(1:1000-1:2000)，一抗浓度过高会导致产生非特异性条带。
吸尽封闭液后，立即加入稀释好的一抗，室温或 4℃在摇床上缓慢摇动孵育2 h。孵育时间：一抗的孵育时间可从2h至过夜（一般不超过 18 h）不等，取决于抗体与蛋白的亲和性和蛋白的含量丰度，建议使用较高的抗体稀释倍数和较长的孵育时间来保证特异性结合。
孵育温度：尽可能低温孵育，如果在封闭液中孵育一抗过夜，应在 4℃进行否则会产生污染而破坏蛋白（降别是磷酸基团）。
孵育一抗时需保持适当的摇动使之均匀覆没膜，防止结合不均匀。
孵育完成后吸取一抗，在方形保鲜盒中加入TBST，将膜放入其中，使TBST没过PVDF膜，在摇床上低速震荡10min，重复洗3次。
3-6二抗孵育
用封闭液稀释二抗至抗体说明书规定浓度，将转有蛋白的PVDF膜浸入装有抗体的方形保鲜盒中，震荡孵育1-2 h。孵育完成后吸取二抗，在方形保鲜盒中加入TBST，将膜放入其中，使TBST没过PVDF膜，在摇床上低速震荡10min，重复洗3-5次。
3-7化学发光
酶促反应比同位素安全且快速，已经成为 Western Blot 的主流检测方法。酶促反应可以搭配不同的底物从而实现不同的显色方法：化学发光和底物显色，前者灵敏度很高，已经达到皮克级别，甚至还有飞克级别的，灵敏度超过了同位素；而后者由于直接显色而操作简便且成本低。
辣根过氧化物酶在H2O2 存在下，氧化化学发光物质鲁米诺（luminol，氨基苯二酰一肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大 1000 倍，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。
发光液（A液、B液）1：1配置（注意避光），用移液器吸取合适量的发光液至覆盖PVDF膜，ECL发光仪上曝光并采集图像。
四、常见问题分析与解决方案












五、试剂及缓冲液配方
1. 试剂:
国药AR：丙烯酰胺(Acr)、甲叉双丙烯酰胺(Bis)、过硫酸铵(AP)、Tris、SDS、甲醇、乙醇、甘氨酸(Gly)、冰乙酸、磷酸、硫酸铵（常温保存）。
2. 其它试剂：BSA、甘油、β-巯基乙醇、溴酚兰、Tween20、TEMED、丽春红、考马斯亮蓝G250/R250（常温保存）；ECL发光液（4℃保存）；二抗、蛋白分子量marker、PMSF（-20℃保存）。
3. 耗材：PVDF膜（millipore）、滤纸、枪头。
4. 缓冲液：30% Acr/Bis（棕色瓶）、10% 过硫酸铵、1×转膜缓冲液、5%BSA或脱脂奶粉封闭液（4℃保存）；1.5M Tris-HCl（pH8.8）、1M Tris-HCl（pH6.8）、10% SDS 、5× SDS凝胶还原型加样缓冲液、10× TBS、10×Tris-Gly电泳缓冲液、10×转膜缓冲液、1× Tris-Gly电泳缓冲液、TBST（常温保存）。
5. 缓冲液配制：
a) 30% Acr/Bis：
丙稀酰胺29.2g，甲叉双丙稀酰胺0.8g，双蒸蒸馏水溶解定容至100ml，过滤备用，4°C棕色瓶保存。
b) 1.5M Tris-HCl（pH8.8）：
Tirs 18.2g，溶于蒸馏水中，定容至100mL。加入盐酸调节pH值至8.8，常温保存。
c) 1M Tris-HCl（pH6.8）：
Tirs 12.1g，溶于蒸馏水中，定容至100ml。加入盐酸调节pH值至6.8，常温保存。
d) 10% SDS：
SDS 20.0g溶于蒸馏水中，定容至200ml，加热至68°C助溶。常温保存。
e) 10% 过硫酸铵(AP)：
过硫酸铵0.1g，溶于1ml 蒸馏水中，现配现用或分装冷冻备用。4°C保存时最多不超过2w。
f) 5×SDS凝胶还原型加样缓冲液：
0.25 M Tris-HCl (pH 6.8) 1ml、SDS 0.25g、甘油 0.189g、溴酚兰 25mg，双蒸水定容到5ml，使用前加入β-巯基乙醇0.5ml。
g) 10× Tris-Gly电泳缓冲液：
Tris 30.2g，甘氨酸188g，SDS 10g，加入双蒸水定容至1L。
1× Tris-Gly电泳缓冲液：用100ml量筒取100ml 10× Tris-Gly电泳缓冲液，加入到1000ml容量瓶中，用蒸馏水定容到1000ml。
h) 10×转膜缓冲液：
Tris 30.3g 、甘氨酸151.1g 、定容至800ml。
1×转膜缓冲液：10×转膜缓冲液80ml、甲醇200ml, 加蒸馏水720 ml。
i) 10× TBS：
Tris 24.2g、氯化钠80g，双蒸水定容至1L，调PH 7.6。
j) TBST：
用100ml量筒取100ml 10× TBS，加入到1L容量瓶中，用蒸馏水定容到1L，再加入1ml Tween 20混合均匀。
k) 封闭液：
2g BSA或脱脂奶粉，溶于装有40ml  TBST的50ml离心管中，配成5% BSA或脱脂奶粉封闭液，现配现用，短期4°C保存，较长时间则冷冻保存。
l) 100mM PMSF：
称量0.174g PMSF(针状结晶固体)溶于10ml 无水乙醇，震荡混匀，保存在-20°C。
m) 2%的丽春红贮备液：
丽春红2g，三氯乙酸30g，磺基水杨酸30g，加水定容至100ml，过滤，常温保存。
丽春红染色工作液：2%的丽春红贮备液 1：10 稀释，即加 9 倍的 ddH2O。
n）考马斯亮蓝R250染色液：
0.25%考马斯亮蓝R250，40%双蒸水， 10% 冰乙酸，50%甲醇混匀，过滤，常温棕色瓶保存。
o）考马斯亮蓝R250染色脱色液：常温保存：
67.5%双蒸水，7.5%冰乙酸， 25%甲醇混匀，常温保存。
p）考马斯亮蓝G-250染液：
10%磷酸，10%硫酸铵，0.12%考马斯亮蓝G-250， 20%甲醇，常温棕色瓶保存。配制方法：按就次序依次加入10%磷酸，10%硫酸铵，等完全溶解后加入0.12%考马斯亮蓝G-250，等完全溶解后加入20%甲醇混匀，过滤。

分离胶配方





                                                               5%浓缩胶配方


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