采用何种方法或手段来评价提取到的核酸样品是否可用？

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采用何种方法或手段来评价提取到的核酸样品是否可用？
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卡卡

评价提取到的核酸样品是否可用是核酸研究和应用中的关键步骤。核酸样品的质量直接影响到后续实验的准确性和可靠性。为了确保核酸样品符合实验要求，可以采用以下几种方法和手段来进行评价：
1. 纯度测定

1.1 紫外吸光度测定
使用紫外分光光度计测定核酸样品的吸光度比值是最常见的方法。通常测定的是260 nm、280 nm和230 nm的吸光度。

• A260/A280 比值：用于评估蛋白质污染。纯净的DNA样品比值在1.8-2.0之间，RNA样品则在2.0左右。如果比值低于这些范围，说明有蛋白质污染。
  
• A260/A230 比值：用于评估其他有机物或盐的污染。纯净的核酸样品比值应在2.0-2.2之间。如果低于2.0，可能存在多糖、酚类或盐类污染。
  

紫外分光光度法测定核酸纯度

1.2 荧光染料法
使用荧光染料如PicoGreen、Qubit等，专门结合DNA或RNA，检测核酸的浓度和纯度。这种方法比紫外吸光度法更灵敏，特别适合检测低浓度样品。
2. 浓度测定

2.1 紫外吸光度法
通过测量260 nm处的吸光度来估算核酸的浓度：

• DNA浓度计算：A260 × 稀释倍数 × 50 µg/mL。
  
• RNA浓度计算：A260 × 稀释倍数 × 40 µg/mL。
  

2.2 荧光染料法
使用特异性荧光染料，可以定量检测DNA或RNA。荧光法的灵敏度高于紫外法，尤其适合低浓度样品和复杂样品。



荧光染料法测定核酸浓度

3. 完整性检测

3.1 琼脂糖凝胶电泳
这是评价核酸样品完整性和降解情况的常用方法。样品电泳后，根据条带的清晰度和完整性来判断核酸的质量。

• DNA电泳：完整的基因组DNA应表现为一条高分子量的条带，无明显拖尾。
  
• RNA电泳：完整的RNA样品应显示出清晰的28S和18S rRNA条带，28S条带的强度应约为18S的两倍。
  

琼脂糖凝胶电泳检测核酸完整性

3.2 Bioanalyzer
利用微流体芯片技术，对核酸样品进行高分辨率电泳分析。Bioanalyzer能精确地测定样品的RNA完整性（RIN值）或DNA片段大小和浓度，特别适合高通量检测。
4. 纯化度测定

4.1 定量PCR（qPCR）
通过定量PCR检测样品中是否存在残留的蛋白质或其他抑制剂。高纯度的样品应在PCR反应中表现出良好的扩增效率和较低的Ct值。
4.2 酶切和测序
通过酶切反应和测序技术，可以检测样品中是否存在污染物或降解产物，进一步评估样品的纯化度。
5. 实验适用性

5.1 RT-PCR或qRT-PCR
对RNA样品进行逆转录PCR或实时定量PCR，评估RNA样品是否适合下游应用。如果RNA质量好，PCR产物应显示清晰的扩增曲线，Ct值较低。
5.2 高通量测序（NGS）
对DNA或RNA样品进行高通量测序，检测其质量是否满足测序要求。高质量的样品应产生高覆盖度、低错误率的测序结果。



高通量测序评价核酸样品质量

结论

核酸提取的评价方法多种多样，从紫外吸光度测定、荧光染料法，到琼脂糖凝胶电泳和Bioanalyzer，再到高通量测序和定量PCR，每种方法都有其独特的优势。通过综合这些方法，可以全面评估核酸样品的纯度、浓度、完整性和实验适用性，确保提取的核酸样品符合高质量的实验需求。

国内在核酸提取领域的产品和技术方案，不论是性能参数，还是质量结果上，都能完全替代进口品牌。并且已经过大规模样本的广泛验证。
但由于下游各类业务的独特性，在实际应用中仍然会遇到各类问题，包括样本处理复杂度、提取效率和产量、纯度和质控、时间和成本、下游应用兼容性等。
我在生物领域从业20多年，对产业上下游业务相关业务的实验，都积累丰富经验。过去几年，已经帮助30多家头部和腰部企业，推动核酸提取试验方案的升级提效。
如果你在项目中遇到核酸提取问题，欢迎私信沟通，可提供专业技术支持，并免费提供试剂供实验评测。


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长长的路

任何分子检测的第一步都是从准备好的样本中正确分离、纯化和提取核酸（DNA 和/或 RNA）。可以使用一系列样品，包括冷冻、新鲜或固定的组织、抽吸涂片和血液。抽吸涂片是较常提交的细胞学标本，应提供在固定的无盖玻片上，或从相应的 FFPE 细胞块中获得的脱蜡 5-20 微米玻璃切片切片中提供。将固定或脱钙样品送去进行分子检测时需要特别小心，因为其中许多试剂可能会导致 DNA 损伤。应使用固定剂和脱钙剂，例如用于固定的 10% 缓冲福尔马林和用于脱钙的 EDTA，以避免核酸降解。



高通量核酸提取设备

核酸提取仪-全自动核酸合成仪-实验室仪器在现代分子实验室中，已成功采用多种提取方法来获得高质量的核酸。常用的核酸提取方法主要有：
1.基于苯酚氯仿和蛋白酶 K 的方法 ；
2.使用磁珠或基于柱的纯化的更现代的物理提取方法。
虽然这些方法在原理上有所不同，但它们都用于去除蛋白质和脂质等污染物，这些污染物会抑制大多数分子测定的核心下游扩增技术。
方法选择在很大程度上取决于技术可用性、测试量以及用于测试的核酸类型。仅纯化 DNA 的方法通常用于鉴定单核苷酸变异、插入和缺失以及某些拷贝数变异。而提取 RNA 的方法通常用于检测基因融合或基因表达的变化。对于更全面的方法，包括许多 NGS 组合，RNA 和 DNA 都是必需的。因此，将选择提取总核酸的策略，以较大限度地减少分析所需的组织量。



nano300

提取后，通过吸光度方法（例如 NanoDrop™、ThermoFisher）或荧光方法（例如 Quibit、ThermoFisher）评估核酸产量和质量。
使用紫外可见分光光度计，获取核酸吸收光较强的波长（260 nm 或 A260）处的吸光度，并使用比尔-朗伯定律计算核酸量，该定律预测吸光度随浓度的线性变化。值得注意的是，DNA 和 RNA 都会吸收 A260 处的光；
因此，其他核酸污染物可能会高估实际产量。还可以通过确定核酸 (A260) 与氨基酸中芳香环的吸光度 (A280) 以及有机化合物和离液盐的吸光度 (A230) 的吸光度比来评估样品纯度。这些比率（A260/A280 和 A260/A230）越高，高纯度 DNA 的 A260/A280 比率范围为 1.7-2.0，RNA 范围为 1.8-2.3，纯度越高。现代荧光方法依赖于选择性结合待测特定核酸（即双链 DNA、RNA 等）的荧光染料。



41003核酸染料

与传统吸光度方法相比，这种选择性具有更高的特异性和灵敏度，特别是在较低的核酸浓度下。这些染料将发出荧光计可以测量的激发波长。然后可以通过将样品中的荧光量与已知标准曲线的荧光量进行比较来计算核酸产量。
因此，较终浓度的准确性取决于标准曲线，因此必须适当选择参考材料。



SYBRgreen

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检验医师

谢邀，首先，利用超微紫外分光光度计检测提取核酸浓度，确定提取质量。
其次，通过设计引物，以提取核酸为模版，检验是否能扩增特定的片段。
最后将扩增的片段进行测序，探究自己提取的核酸是不是自己想要的。

检验医师

跑个琼脂糖电泳检测一下完整性就可以了，分光光度计测不测无所谓，电泳能检测到很多关键信息。
基因组DNA和总RNA都可以用电泳检测好坏的，好坏标准不用我多说了吧，不懂的看看书或者网上查一下就知道了。