立即注册找回密码

QQ登录

只需一步,快速开始

微信登录

微信扫一扫,快速登录

手机动态码快速登录

手机号快速注册登录

搜索

图文播报

查看: 123|回复: 5

[分享] 蛋白组学数据回来了,给了我一个蛋白质定量和差异分析边,还有go分析和kegg分析的表,下一步我该干啥?

[复制链接]
发表于 2024-10-26 09:32 | 显示全部楼层 |阅读模式
回复

使用道具 举报

发表于 2024-10-26 09:33 | 显示全部楼层
研究背景

炖牛肉因风味独特、营养丰富深受欢迎,但易氧化变质。而茶叶富含抗氧化成分,在炖牛肉中加入茶叶可保持其品质并提升营养价值。然而,不同茶叶对炖牛肉品质的影响机制尚未明晰。近年来,多组学技术如蛋白质组学和代谢组学在食品分析领域崭露头角,可全面解析食品中蛋白质和代谢物的变化,为揭示炖牛肉品质变化的分子机制提供有力工具。




近日,陕西师范大学食品工程与营养科学学院刘永峰团队在Food Research International在线发表了题为“A comprehensive multi-omics analysis, integrating proteomics and metabolomics, was employed to elucidate tea-induced stewed beef quality change mechanisms”的论文,该研究通过对不同茶叶炖煮后的牛肉进行蛋白质组学和代谢组学分析,阐明茶引起的炖牛肉品质变化机制
研究方法

材料分组:将60块牛肉随机分为5组,每组12块。分别是:对照组(CON):不添加任何茶叶、绿茶组(GT)、红茶组(BT)、茉莉花茶组(JT)、黑茶组(DT)。通过测定pH值、颜色、剪切力、质地等指标评估不同茶叶处理对牛肉品质的影响。
每组取6块牛肉,分别进行蛋白质组学和代谢组学分析。研究结果
1. 不同茶叶炖煮对牛肉的品质影响

加入茶叶后,牛肉的pH值下降,尤以黑茶组最为明显。颜色上,茶叶使牛肉亮度降低、红度增加,黑茶和普洱茶效果尤佳。同时,牛肉的剪切力和硬度明显降低,表明茶叶有助于提升牛肉嫩度。对照组剪切力和硬度最高,而黑茶和绿茶组分别在这两项指标上表现优越。总体而言,茶叶对改善牛肉嫩度具有积极作用,其中黑茶效果最佳,是提升牛肉品质的优选方案


2. 蛋白质组学分析

蛋白质组学分析发现:不同茶叶处理组中差异蛋白的GO功能富集存在显著差异。与对照组相比,添加绿茶、红茶、茉莉花茶和黑茶后,分别有19、10、42和14个差异表达蛋白。GO功能富集分析结果显示,图2(a)绿茶组与对照组之间的差异蛋白主要富集于细胞内运输、蛋白质甲基化、蛋白质烷基化、大分子甲基化等生物过程图2(a)。红茶组与对照组之间差异蛋白主要富集于中间丝、中间丝细胞骨架、锰离子结合等生物过程图2(b)。茉莉花茶组与对照组之间差异蛋白主要富集于线粒体部分、线粒体外膜、醌代谢过程等生物过程图2(c)。
黑茶组与对照组之间差异蛋白主要富集于整体膜、细胞器膜、线粒体外膜等生物过程图2(d)。





KEGG通路富集分析显示:绿茶处理组与对照组之间差异蛋白主要富集通路包括甲状腺激素信号通路、AMPK信号通路、JAK-STAT信号通路和脂肪酸降解等图3(a)。红茶处理组与对照组之间差异蛋白主要富集通路包括雌激素信号通路、Th1和Th2细胞分化、Toll样受体信号通路等图3(b)。茉莉花茶处理组与对照组之间差异蛋白主要富集通路包括蛋白质消化与吸收、Apelin信号通路、热产生等图3(c)。黑茶处理组与对照组之间差异蛋白主要富集通路包括花生四烯酸代谢、叶酸生物合成、碳水化合物消化与吸收等图3(d)。



研究者进一步分析了23个差异蛋白与牛肉品质之间的相关系数。结果显示:




肌球蛋白重链4 (E1BP87) 与pH值显著相关
肌球蛋白2 (Myosin-2)与L值、a值、b*值、硬度、剪切力显著相关
脂肪酸结合蛋白 (P10790 )与pH值显著相关
淀粉结合域1 (E1BAJ4 )与L值和b值显著相关
β-热休克蛋白6 (Q148F8 )与L*值显著相关
其他蛋白与质量特征参数的相关性不显著。
因此,与茶叶炖牛肉质量特征显著相关的蛋白包括肌球蛋白-2、淀粉结合域1、β-热休克蛋白6等,它们可能是茶叶炖牛肉质量的潜在生物标志物
3. 代谢组学分析

非靶向代谢组学分析结果显示:绿茶、红茶、茉莉花茶、黑茶处理组的差异代谢物对牛肉质量的影响各不相同,显示了不同茶叶的独特作用机制。

差异代谢物参与的主要代谢通路包括嘌呤代谢、蛋白质消化和吸收、戊糖磷酸途径、氧化磷酸化、脂肪酸降解、柠檬酸循环等。茶叶中活性成分通过调控代谢通路,影响了牛肉中的碳水化合物、氨基酸、脂质等营养成分,可能是茶叶影响牛肉质量的关键机制之一




4. 蛋白组学与代谢组学联合分析

蛋白质组学和代谢组学的联合分析揭示了差异表达蛋白和代谢物对碳水化合物、氨基酸、脂质等营养成分相关代谢物的显著影响。



差异蛋白与代谢物相关性分析
通过皮尔逊相关分析方法计算差异表达蛋白与差异表达代谢物之间的相关性系数,结果显示:
绿茶组中,蛋白A0A0N4STN0、E1BPX9、F1MWY9、Q02337、Q05752和Q2KHU2与19、18、13、6、18和15个差异代谢物显著相关。
红茶组中,蛋白A0A3Q1MNW1、A0A452DJG7、A5D7D1、Q0VBZ1和Q2KHU2与151、122、121、103和128个差异代谢物显著相关。
茉莉花茶组中,蛋白A0A3Q1LZ02、A0A3Q1MNW1、P05630、P05631、Q3T0W4和Q3SZ00与67、86、83、78、65和66个差异代谢物显著相关。
黑茶组中,蛋白A0A3Q1MNW1、A0A3Q1MQ68、A4IFM8、A5D9H5和Q3T085与20、15、30、20和26个差异代谢物显著相关。
结论

黑茶显著改善了炖牛肉的嫩度。它们对炖牛肉中与蛋白质氧化磷酸化、脂肪酸降解、氨基酸降解和过氧化物酶体相关的途径产生了重大影响。蛋白质组学和代谢组学的联合分析表明,不同茶叶炖煮产生的差异蛋白显著可以影响与碳水化合物、氨基酸、脂质和其他营养素相关的代谢物。肌球蛋白-2(L*值和剪切力)、淀粉结合域1(L值和b值)、热休克蛋白β-6(L*值)和肌球蛋白重链4(pH值)与炖牛肉的品质特征显著相关,使其成为这些品质特征潜在的生物标志物。
回复 支持 反对

使用道具 举报

发表于 2024-10-26 09:34 | 显示全部楼层
主要根据研究目的而定,以机制研究为例,我们需要做到以下两步
1.首先要弄清楚我们的研究目如何与蛋白质组学数据结合,主要分为4步:实验设计,蛋白组技术选择,文章分析数据挖掘,以及蛋白验证,目前阶段一二部应该以及完成,如果需要详细了解,可看下这篇文章
蛋白质组学专题 | 必看干货:疾病机制研究文章中必要因素有哪些?2、对数据挖掘并进行验证
目前蛋白质组学机制文章中常出现的分析类容有差异蛋白筛选、PCA分析、共有蛋白筛选、火山图、聚类分析、GO富集分析、KEGG富集分析、部分蛋白差异展示、ROC分析、临床特征相关性分析、蛋白相关性分析、互作网络图、生存分析。出现频率超过60%的分析为差异分析、GO富集分析、聚类分析、KEGG富集分析、部分蛋白差异展示,以上分析基本为文章必备。部分析内容虽频率较低,但对于确定候选蛋白明确疾病机制具有重要意义,如临床特征相关性分析、蛋白互作分析、生存分析等。
差异蛋白质筛选条件、GO/KEGG富集分析意义、聚类分析用法可见下面文章
蛋白质组学专题 | 蛋白质组文章怎么写?学会6条分析内容就搞定希望对你有用!
回复 支持 反对

使用道具 举报

发表于 2024-10-26 09:34 | 显示全部楼层
关注“Being科学”微信公众号

了解更多精彩内容和福利!!


大多数药物对蛋白质本身起作用,会导致蛋白质的生成或降解,或以其他调控蛋白质的方式来发挥其治疗效果。药物调节蛋白翻译后修饰(PTMs)可以构成分子靶点参与标记,可以识别药物调节途径,并可以阐明细胞的下游表型反应。PTM特异性抗体最常用于此目的。


然而,只有少数PTM特异性抗体存在,使药物作用机制(MoA)的研究偏向于表征良好的蛋白质和途径。由于不同细胞类型的药物反应往往不同,因此在蛋白质组范围内对药物进行表征以了解其MoAs是很重要的。因此,蛋白质组学已成为药物发现和化学生物学的重要工具。近日,德国慕尼黑工业大学的Bernhard Kuster教授《Science》上发表了题为“Decrypting drug actions and protein modifications by dose- and time-resolved proteomics” 的报道。在该研究中,他们引入了一种名为decryptM的蛋白质组学分析,量化了细胞中数千个PTM的药物PTM调节,以阐明靶点参与和药物作用机制(MoA)。




DecryptM:PTMs的全蛋白质组药物剂量反应谱
研究者提出了一种称为decryptM的定量蛋白质组学方法,能够通过系统测量不同癌症药物对细胞内PTM的剂量(和时间)分辨调制来评估靶点和通路的参与以及MoA。简单地说,细胞用浓度不断增加的药物处理,并使用稳定的同位素进行多路复用。通过离线色谱法对胰蛋白酶肽进行分级以进行蛋白质组表达谱分析,并通过免疫沉淀或固定化金属亲和色谱法富集携带PTM的肽。在LC-MS/MS分析之后,通过四参数逻辑回归拟合和过滤S形曲线,从TMT报告离子强度中推导出每个肽的剂量反应特征。


解密药物和PTM
与在一个(通常是高)药物浓度下测量重复药物效应大小的传统差异方法相比,DecryptM药物谱更具信息性。这是因为剂量-反应曲线产生EC50值、效应大小和额外的曲线拟合参数。DecryptM测定是可重复的,所有测定的EC50值的70%和90%分别在药物浓度的半个对数或一个对数内。DecryptM分析显示,大多数受调控的磷酸肽及其参与的途径都与其靶标的效力密切相关。药物靶点亲和力(pKD)和细胞内药物PTM效价(pEC50)之间的这种密切一致性增加了一种令人兴奋的可能性,即功能上未表征的PTM位点可能被置于已知的途径中。
1)化疗药物在K562慢性骨髓性白血病细胞中,为微管稳定剂紫杉醇和抗代谢物胞苷和甲氨蝶呤生成了DecryptM。在实验的时间范围内(30分钟的药物治疗),只有两种磷酸肽显示出甲氨蝶呤的调节作用,这些与抗叶酸相关的生物学没有联系。对于紫杉醇,7438个测量的磷酸肽中有7个上调,EC50值约为1μM。相应的蛋白质MAP7、MAP7D3和ARHGEF2都在微管稳定中发挥作用。这一结果证明了剂量依赖性测量可以称之为药物调节的极端特异性,并表明紫杉醇的分子MoA在30分钟后就可以检测到了。对于阿糖胞苷,23个磷酸肽被有效调节,并且许多潜在的蛋白参与了DNA损伤反应。这些磷酸肽中的大多数在PhosphoSitePlus中被注释为对电离辐射或UV光作出反应。其中8个在SQ位点磷酸化,SQ位点是DNA损伤反应激酶ATM和ATR的底物基序,并且有几个确实被证明是这些激酶的底物。这些数据表明,早在观察到任何表型变化之前,DecryptM图谱就可以在30分钟内检测到细胞对DNA损伤的反应。
2)蛋白质相互作用抑制剂SHP099是非受体酪氨酸磷酸酶SHP-2(PTPN11)的变构抑制剂。它通过稳定SHP-2的非活性形式抑制癌症细胞的生长,从而通过受体酪氨酸激酶(RTK)阻断MAPK通路的激活。这种MoA反映在EGFR过表达的食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-520中SHP099的30分钟DecryptM谱中。尽管SHP099不抑制指示EGFR活性的磷酸化位点,但EGFR底物GAB1的磷酸化以剂量依赖的方式减少。这是因为GAB1不能再通过SHP2与EGFR结合,而这种解偶联阻止了MAPK1/3的激活。MAPK1/3下游蛋白质上的磷酸化位点受到类似的抑制。包括许多转录调控因子在内的约30种其他蛋白质也显示出100-500nM之间的EC50值。目前的分析将这些蛋白质和磷酸肽置于RTK-MAPK轴的功能背景中,并说明了药理学SHP-2失活如何导致致癌信号和转录活性的快速分解。
3)蛋白酶体抑制剂蛋白酶体处理被磷酸化和泛素化标记为降解的蛋白质。硼替佐米(BTZ)和卡非佐米(CFZ)已成为治疗多发性骨髓瘤的中坚力量。两种药物都通过与蛋白酶PSMB5的可逆共价(BTZ)或不可逆(CFZ)结合来抑制蛋白酶体。在多发性骨髓瘤细胞系RPMI 8226中的二维decryptM图谱显示出两种药物大致相似的效果。随着时间的推移,调节的磷酸化位点的数量急剧增加,包括细胞应激的非常强烈的激活。二维decryptM数据还显示,随着时间的推移,药物作用变得更加强烈。这可以通过药物的缓慢结合模式或共价性质来解释,可能会随着时间的推移减少功能性蛋白酶体的数量。


4)表观遗传药物癌症细胞增殖需要频繁的染色质重塑。因此,赖氨酸乙酰转移酶(KATs)和赖氨酸脱乙酰酶(KDAC)已成为药物靶点。为了进一步了解它们的细胞MoAs,研究者将decryptM方法扩展到HeLa细胞中的蛋白质乙酰化。CUDC-101是一种双多激酶和HDAC1/2/3抑制剂,在1133个测得的乙酰化肽中,上调139个,具有纳摩尔效力。磷酸肽的效力要弱得多,这表明CUDC-101在细胞中与HDAC靶标的亲和力是其激酶靶标的100倍。HDAC抑制剂vorinostat在4小时内对蛋白质磷酸化也没有明显影响。相比之下,天然化合物romidepsin在16小时后触发了磷酸蛋白质组的广泛而有效的反应,这可能与HDAC抑制有关,但也可能是由于延长了孵育时间而导致的,这是因为这种肽药物的起效速度慢。


5)激酶抑制剂激酶抑制剂(KI)已成为重要的药物,尤其是在肿瘤学中。尽管它们的靶点分布和选择性已经被广泛研究,但关于这些药物在细胞中影响哪些PTM,人们知之甚少。为了系统地解决这个问题,研究者对A549肺癌细胞中具有不同靶谱的10个KI进行了解密。这项调查揭示了蛋白质结构域和无序区域中药物调节的磷酸肽。泛激酶抑制剂staurosporine对近2500个磷酸肽进行了广泛的调节。所有其他药物显示出较少的调节磷酸肽,并且由于靶向激酶较少,pEC50分布较窄。然而,许多KI显示出双峰pEC50分布,这意味着在非常高的浓度下,不同的靶标和途径具有不同的效力或非特异性的细胞毒性。


6)抗体治疗性抗体标记细胞以供免疫系统识别,阻断受体-配体相互作用,消除细胞内生存信号传导,或促进死亡诱导途径。有趣的是,即使是一些最成熟的治疗性抗体的细胞内MoAs仍然相当不清楚。例如,研究者将decryptM分析应用于乳腺癌治疗药物曲妥珠单抗(通过阻止HER2二聚体来阻断信号传导)和帕妥珠单抗(通过阻止HER2-HER3二聚体阻止信号传导)。与拉帕替尼形成鲜明对比的是,曲妥珠单抗对细胞磷酸蛋白质组都没有显著影响。BT-474球体的活细胞成像显示,拉帕替尼导致其快速崩解,但在曲妥珠单抗治疗下,球体在七天内继续生长。decryptM数据与其他报道一致,因为曲妥珠单抗的MoA不包括阻断有丝分裂信号传导的明确元素。帕妥珠单抗的decryptM分析表明帕妥珠单抗切断了HER3-MAPK和HER3-PI3K/AKT信号轴,并解释了帕妥珠单抗如何延缓乳腺癌症的细胞周期进展。
总而言之,上面的例子旨在说明decryptM在表征药物的MoA、产生药物特异性PTM特征、研究耐药性机制以及将意义不明确的药物调节的PTM位点置于功能环境中的巨大潜力。考虑到这里开发的简化工作流程,现在可以大规模执行decryptM。该方法应可扩展到任何通过影响PTM或蛋白质表达来调节细胞活性的分子,包括GPCR配体、细胞因子、趋化因子、共因子、代谢产物、生物制品、肽或激素等。
回复 支持 反对

使用道具 举报

发表于 2024-10-26 09:34 | 显示全部楼层
文章标题:The pro-inflammatory effect of triglyceride on human CD4+ T cells and experimental autoimmune uveitis
发表期刊:Clinical Immunology
影响因子:10.19
作者单位:重庆医科大学第一附属医院
百趣生物提供服务:TMT标记定量蛋白质组学、脂质代谢组学
研究背景-代谢组学分享
贝赛特氏症(Behçet's disease, BD)是一种慢性、复发性自身炎症性疾病,以多系统血管炎为特征,涉及皮肤、黏膜、眼睛、神经系统和关节。近些年来的研究表明,脂质代谢异常在自身免疫性疾病的炎症和进展中发挥作用。甘油三酯(Triglyceride, TAG)是一种中性脂类,由三种脂肪酸和一个甘油主链组成。既往研究显示,BD患者中TAG高表达。此外,TAG过高会导致促炎因子的产生和分泌,但其确切机制尚不清楚。本研究基于TMT标记定量蛋白质组学脂质代谢组学(均由百趣生物提供)研究了BD的脂质组学特征,并评估了TAG对小鼠自身免疫性葡萄膜炎(Experimental autoimmune uveitis, EAU)的影响,揭示了其潜在的细胞和分子机制。
主要实验-代谢组学分享


研究结果-代谢组学分享
01脂质代谢组学分析显示活性BD患者脂质代谢明显异常
为了检测活性BD患者的脂质改变,作者对活性BD患者和健康对照组血浆样本进行了脂质代谢组(百趣生物提供)分析,共鉴定出574种不同的脂类。在活性BD患者中,TAG(56:4)_FA18:0、TAG(56:4)_FA 20:2和SM(18:1)三种脂质表达显著上调,DAG(16:0/18:0)、Cer(18:1/24:0)和FFA(18:0)三种脂质表达显著下调。OPLS-DA显示,这两组之间有明显的簇分离。进一步采用ROC曲线确定这6种脂质代谢物中哪一种与BD密切相关。由于最后两种脂类已被证明与促炎因子的产生有关,作者在接下来的实验中选择了TAG作为候选(图1)。


图1. 脂类组学和ROC曲线鉴定的脂类代谢物
02TAG能促进CD4+T细胞的增殖和分化,但对中性粒细胞无作用
作者研究了TAG是否影响CD4+T细胞的增殖和活化。结果发现,TAG刺激的CD4+T细胞增殖明显增强,TAG还能显著提高IL-17和干扰素-γ的基因和蛋白水平。经TAG刺激后,Th17/Th1细胞数显著增加。此外,作者研究了TAG是否对中性粒细胞有调节作用。结果表明,TAG对中性粒细胞IL-17和MCP-1的表达和增殖均无影响(图2)。


图2. TAG促进CD_4~+T细胞的增殖、IL-17和干扰素-γ的产生以及Th1/Th17细胞的分化,对中性粒细胞无明显影响
03A922500可减轻EAU的严重程度
作者设计了一项体内实验,通过A922500(TAG抑制剂)来研究其在EAU模型中的作用。结果发现,A922500处理组小鼠的组织学评分明显降低。免疫后第14天,A922500处理组小鼠血浆TAG水平显著降低,CD4+T细胞中IL-17的mRNA和蛋白表达显著降低,而IFN-γ的mRNA和蛋白表达未见影响(图3)。A922500还能抑制Th17细胞的分化。然而,它既不影响Th1细胞分化,也不影响中性粒细胞中IL-17和MCP-1的表达(图4)。


图3. A922500抑制EAU的组织学严重程度,并降低血浆TAG水平


图4. A922500抑制IL-17的产生和Th17细胞的分化
04蛋白质组学揭示了A922500对EAU小鼠脾脏CD4+T细胞蛋白表达的影响
为了进一步研究 A922500对小鼠脾CD4+T细胞蛋白表达的影响。作者采用TMT蛋白质组学(百趣生物提供)分析显示,在A922500处理组和对照组之间共鉴定出71个差异表达蛋白(DEPs)。其中,A922500处理组有56个蛋白质表达下调,15个蛋白质表达上调(图5A)。在此基础上建立了差异表达基因的PPI网络,在该网络中确定了32个节点(图5B)。根据GO注释,揭示了71种蛋白质在生物过程(BP)、细胞成分(CC)和分子功能(MF)的表达。其中抑制水解酶活性相关的生物过程富集显著(p<0.001),抑制酶活性等分子功能也富集显著,对于细胞成分,蛋白质主要富集在细胞外、富含三油甘脂的血浆脂质体等区域。


图5. A922500处理和对照组中EAU小鼠CD4+T细胞的蛋白质组学分析
05A922500可能抑制凋亡通路相关蛋白Akt
本研究发现在A922500处理的小鼠中,Pik3r2的表达增加,该蛋白已经被证明能通过抑制PI3K/Akt信号通路促进细胞凋亡。进一步设计实验,探讨A922500的抗炎作用是否可能通过细胞凋亡介导。作者的研究结果显示,在A922500处理的小鼠中,p-Akt的表达显著降低,提示其对CD4+T细胞的PI3K/Akt通路有抑制作用(图5D)。
结论-代谢组学分享
在这项研究中,作者描述了活性BD患者的脂质代谢紊乱特征,揭示了TAG具有促炎作用。此外,TAG可刺激CD4+T细胞增殖、IL-17和IFN-γ表达及Th1、Th17细胞分化,但对中性粒细胞无影响。A922500抑制TAG的产生,降低体内CD4+T细胞Th17和IL-17表达,可改善EAU严重程度。蛋白质组学分析显示,A922500处理小鼠CD4+T细胞中凋亡相关蛋白Pik3r2上调。上调Pik3r2可抑制PI3K/Akt信号通路,导致细胞失活,从而缓解EAU活性。这些结果提示,抑制TAG产生可显著改善EAU活性,且TAG可能作为Th17细胞介导的眼内炎症防治研究的靶点。
文献下载链接:
https://pan.baidu.com/s/1T5aTa4U8FXRV5o7HJsOh-w
提取码:0000
回复 支持 反对

使用道具 举报

发表于 2024-10-26 09:35 | 显示全部楼层
虽然发现这个问题比较晚,也不知道作者到现在解决了没有,以专业的角度,我还是给您一个比较详细的回答:

蛋白质组学的定量数据及常规的GO、KEGG分析,通常是为后续的讨论和研究提供线索。
常规的后续研究思路是,挑选最可能与研究问题相关的蛋白,先通过其他定量实验验证其质谱定量数据,然后在与研究问题相关的细胞系或动物模型中对蛋白进行敲除或过表达,检测与研究问题相关的表型以验证选定蛋白的功能,之后还可以探索和验证该蛋白行使或调控相关功能的分子机制。
挑选最可能与研究问题相关的蛋白的思路通常有以下几种:1)选择定量数据中组件差异最显著(一般时表格中差异倍数最大或最小,且P值小于阈值的蛋白)的部分蛋白;2)选择GO、KEGG分析富集到的条目中富集程度最显著(一般是富集分析P值最小的注释条目),或其描述最可能与研究问题相关的条目中的蛋白;3)根据自身研究背景,查询检索所有差异蛋白的已有研究报道,选择与自身研究问题相关的蛋白。以上方法通常会结合使用。
验证质谱定量数据通常使用PRM、WB、ELISA、IHC或qPCR等。PRM是基于质谱的蛋白质靶向定量技术,可基于已有的质谱数据设计方法,通常验证成功率较高;WB、ELISA、IHC均为基于抗体的蛋白质定量检测方法,需要对抗体效果进行验证,否则可能出现假阴性;由于蛋白表达水平和mRNA水平并不一定完全一致,通常不建议通过qPCR的方法验证质谱定量数据。目前质谱定量的准确性已获得高度认可,如果不进行后续的功能探索和验证,也可不进行质谱数据的验证。
验证选定蛋白功能时,细胞系和动物模型的选择,以及相关表型的检测需要根据自身的研究课题进行设计。通常来说,动物模型的研究意义更显著,但同时实验难度、周期和成本也更高。在大多数情况下,蛋白敲除的表型变化会比过表达更显著。
验证出选定蛋白的功能后,可进一步探索其调控相关功能的分子机制。这方面的实验设计更为个性化,可参考以下思路:1)通过功能蛋白质组学,如敲除/过表达和野生型细胞系/动物模型的定量蛋白质组比较筛选该蛋白敲除或过表达之后影响的下游蛋白和信号通路,或是通过互作组学寻找与该蛋白相互作用的上下游蛋白,再通过分子实验探索验证这些上下游蛋白和信号通路与所选蛋白之间的关联;2)检索该蛋白或类似蛋白的相关研究报道,提出调控模型的假设进行验证。
如果短期内没有进行基础实验的条件或计划,或是需要以现有的蛋白质组学数据和分析结果整理后进行论文撰写或作为基金申报的前期结果,也可能从定量数据和GO、KEGG分析结果中选择蛋白进行讨论。此时通常需要结合所选差异蛋白或注释条目、信号通路的已有研究,例如:1)已有研究认为这些蛋白具有某些功能,与我们的研究问题具有一定的相关性;2)我们首次发现这些蛋白或信号通路可能与这些功能或表型相关。
希望能够帮助到你,如果还有其它问题,可以在底下评论
回复 支持 反对

使用道具 举报

发表回复

您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册 微信登录 手机动态码快速登录

本版积分规则

关闭

官方推荐 上一条 /3 下一条

快速回复 返回列表 客服中心 搜索 官方QQ群 洽谈合作
快速回复返回顶部 返回列表