柱层析（过柱子），一文从入门到精通

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我们常说过柱子其实就是柱层析分离，也叫柱色谱，1903年由俄国科学家首次发明使用，其把植物色素的溶液经过粉碎的碳酸钙粉末，发现从上到下在碳酸钙粉末上有不同的色带，通过对不同色带的分开提取，得到了较纯叶绿素，叶黄素等。
该方法经过经过百年的发展至今已经比较成熟，固定相也从单一的碳酸钙粉末发展到了氧化铝（又分为酸性、中性、碱性），硅胶，活性炭等，其中各大实验室最常用的便是硅胶，一般分为正相硅胶和反相硅胶！固定相（硅胶）一般要经过纯化和活性处理，颗粒大小应当均匀统一，理论上其颗粒越小、同单位质量表面积越大，吸附能力就越高，分离效果也就越好。但是实际使用中固定相的颗粒太小时往往会存在两个情况：一个是其质更轻，容易飘散在空气中（硅胶进入人体无法降解，越细越毒）；二是颗粒小也会导致颗粒之间缝隙小，从而使溶剂的流速就太慢，耗时；以硅胶为例，目前已经商业化用量最大的硅胶尺寸为200-300目。过柱手段这块，除了前面说的正向循环制备，高效液相制备，过柱机这些自动分析的设备，手动过柱方面主要分为常压过柱，减压过柱，加压过柱三种。其中：减压过柱，因为洗脱剂流速过快，会损失大半部分塔板数，分离效果较差，适合分离TLC板子分的比较开的样品，尤其适合产物只有一个大极性杂质的样品；所有其大多数时间被用于化合物的预处理，过掉部分杂质后再仔细纯化。相关内容见：快速纯化样品的关键技术——硅胶短柱常压过柱是三者中分离效果最好的一种过柱方式，但是因为很多时候溶剂走的太慢，分离效果再好也会影响效率，所以这时候一般会给与压力，这就是所谓加压过柱；加压过柱压力不宜过高，一般手动的用双链球，自动的就用个养鱼泵，两者都可以如图改装一下。


前面的内容算一些介绍，下面将以正相柱层析为例子，我们讲一下常规的上样、过柱流程：
1，准备工作要做好选取柱子时，观察有无砂板，没有砂板的柱子记得底部填一些棉花，棉花不宜太厚也不宜太薄，能挡住硅胶不下来就好。这里面涉及到一个比较争议的问题，即甲醇过柱子会不会溶解硅胶?个人的经验是不会，一个解释见：是谁在鼓吹用甲醇过柱子会溶解硅胶？配套的准备好最小极性的的洗脱剂，紫外灯（实验室个人推荐手提式，随时可以照一照），加压设备，以及试管架！
2.选取合适的柱子，加入硅胶，浸润硅胶，拍平柱子的选取非常重要，大小应该根据产物的量来计算，一般可以分为：几毫克的柱子（全合成最终的选择）；几十毫克的柱子（方法学扩底物）；500毫克到1克的柱子（方法学做原料）；5~100g左右的柱子，以及更大规模。
实验室最常见柱子直径和高度比值一般在1:2.5到1:15之间，上样时硅胶量是样品量的20～40倍左右。选取柱子的标准要实际根据你样品的TLC爬板情况来，如果杂质很多挨得很近，那么尽可能选大一丢丢的柱子，使你的样品正好能铺一小薄层（建议厚度在5mm以下），如果杂质很远，这个厚度自然也可以提高，但也不建议你样品厚度超过2cm，除非这个产物就是简单冲一冲就行。很多人会犯一个错误，就是想着我硅胶多加点，加的高高的，我样品上厚一点是不是也可以分离的很好？这个答案是否定的！理由是底下的样品和上面的样品不是在同一起跑线，这样只能的到一部分纯的，大部分是交叉的，过不纯不说，浪费时间浪费溶剂！这也是为什么样品要求铺薄的原因！
选取柱子后，加入硅胶时可以通过加料漏斗，同时一定要戴上口罩在通风橱里操作，原因是硅胶吸入人体后无法代谢，会将你的肺部打成筛子。硅胶粉是最毒的粉末之一，矽肺病约占全国尘肺病的50%！至于浸润硅胶，推荐的的流程如下：
①先把装好硅胶的硅胶柱竖直放好，硅胶表面用手拍平，
②硅胶柱底部连接水泵，把硅胶抽实，然后从上面倒入极性最小的洗脱剂，到洗脱剂刚要漏下时，关闭截止阀，防止溶剂抽到水泵。
③在加压状态，用最小的展开剂冲七八个柱体积就可以把硅胶浸润地均一。


3、上样
上样分为湿法上样和干法上样。湿法上样，建议的做法是：用胶头吸管吸取样品，靠近硅胶最上面切面，缓慢均匀滴加样品，直到覆盖一层，然后停止加样，给点压力让油状物沉浸到硅胶层里；油状物沉浸到硅胶层里后重复这种操作多次，直至全部上完样！有些新同学可能好奇为什么这样操作，而不是一次性把湿法上样的油状物一次性上完呢？答案是这种操作可以减少样品层的有效高度。即使还没有加洗脱剂，但当油状物浸入硅胶的那一刻，柱层析就已经开始，后面的样品相当于溶剂在推动前面的样品在硅胶里吸附、解吸附。至于干法上样，除非万不得已菜籽是不推荐的，固体样品更推荐打浆或者结晶：歪门邪道，乙酸乙酯VS水，超声波震荡助力高沸油状物结晶分享一种实验室重结晶的方法等等。干法上样一般会带来两个方面的问题；①拌样的过程中因为要升温旋蒸，增加了样品和硅胶之间反应的可能性；②干法上样就意味着样品层里会引入吸附剂，增加了样品层高度或柱子的尺寸，需要更多的时间，更多的溶剂。
如果不得已选择了，拌产物的硅胶用量一般以1~2倍样品量为宜。其上样直接把吸附好的粉慢慢倒进柱子就好，一些要求和湿法类似。
4、加入无水硫酸钠或石英砂
为了避免在加洗脱剂时撞击到样品层，使其不均匀，变形，影响分离效率，一般会在样品层上面铺一层无水硫酸钠或者石英砂。
也有见到加棉花的，但是掏出来就有点费劲了。菜籽个人喜欢铺无水硫酸钠，因为它还有干燥的功能，对于二氯甲烷这种易挥发吸热产生冷凝水的溶剂比较友好！
至于高度多少，就看自己的手法了！


5，梯度洗脱，采样收集
在上样之后，个人喜欢先用小极性溶剂（基本不会让产物下去的溶剂）冲柱2-3个柱体积，确保上下均一，然后选比例洗脱。
至于过柱子的洗脱剂怎么选？“洗脱剂的比例是你产物TLC爬板爬到Rf值约0.2时的比例。”这是菜籽看到很多书中以及很多博主分享的过柱经验，实际过程中也大差不差，个人来讲更喜欢缩小一倍梯度洗脱。
比如如果TLC爬板展开溶剂是PE/EA=2:1，菜籽更可能从PE/EA=4:1开始梯度洗脱，洗脱到PE/EA=2:1结束，一般效果更好。还有收集洗脱液的时候也是有技巧的，可以先选大一点的试管接收，TLC快到目标点了就换成小一点的试管，这样可以减少多接一点的可能性，不易包杂。
如果遇到杂质点和产物点挨得比较近的情况，特别是那些荧光又比较弱的，记得不要加压，应选常压过柱，每次接半管或更少就换管，也可以提高纯化几率。
6、柱子切忌不要及时处理！
很多新人有个习惯,过柱到了后期，TLC后面一两管没有产物，就默认柱子过完了，压干处理掉。等到一计算收率才发现收率偏低，或者去打谱发现谱图不正确，抓错点了，后悔莫及。所以菜籽建议您过完想要的点后柱子不要急忙处理，打核磁做收率都匹配之后再处理。如果忙，或者急着用这根柱子纯化其他化合物，建议换大极性良性混合溶剂冲一下，把这部分洗脱液单独留下来等鉴定结果。实际上，个人过柱的那些年，在看似出完产物的时候，都会换大极性溶剂冲一冲。遇到过有些东西一开始不了解形状，实际溶解性很差在柱子上断断续续出来，如用纯EA确定冲不出来了，但一旦换成二氯甲烷：甲醇体系，还会有！

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