小白做实验之RT-PCR

虎威将军

首先，解释一下为什么是小白做实验。原因很简单，就是小硕一枚，刚刚进实验室报道，由于本科阶段没有真正做实验的经历，所以现在对于什么提RNA，养细胞，细胞转染，设计引物，构建载体.....完全是一脸懵的状态。故而决定在知乎写文章以记录我的进阶之路，希望在这里与大家共同探讨问题，共同进步~~~
今天跟着小老师学了RNA提取，RNA的逆转录（RT-PCR），在这里说一下real-time PCR（也就是qPCR）是实时定量PCR，指的是PCR过程中每个循环都有数据的实时记录，因此可以对起始模板数量进行精确的分析。虽然Real-time PCR（实时荧光定量PCR）和 Reverse transcription PCR（反转录PCR）看起来都可以缩写为RT-PCR，但是，国际上的约定俗成的是：RT-PCR特指反转录PCR，而Real-time PCR一般缩写为 qPCR（quantitative real-time PCR）【来自丁香通】
RT-PCR就是把提取的RNA先逆转为cDNA，再以这个cDNA为模板进行pcr扩增的过程。
概念弄清楚了，接下来就是步骤了。
一：提取组织
我们提的是小鼠的脂肪，就是解剖之后把相应部位的脂肪剪下来就ok了。注意剪下来马上放液氮里冻存，取好的组织可以马上进行下一步实验，也可以冻着过几天再做。我师兄习惯隔天再做。但最好一周内用完。
提取RNA实验前的准备
用超净台，用之前开紫外照射，把RNAase free水，需要管，大中小枪头，镊子，和板子。
放入超净台，不吹风，用镊子装枪头，摆EP管。
3大步：裂解Trizol    萃取CHCL3 （氯仿）   沉淀异丙醇。
二：破碎和提取
【1】准备冰盒，1.5毫升EP管，每个管里加1毫升Trizol，放冰盒上，从-80°C拿出之前取好的组织，放入液氮。
【2】把冻好的组织用小镊子夹出放入1毫升Trizol中，用匀浆仪破碎，破碎完一个用氯仿洗几下匀浆仪，换下一个组织。小镊子不用的时候可以放液氮里降温。

【3】在超净台中静置10min—15min，静置时间根据组织块大小决定。
【4】把油层吸走，吸200微（沿管壁转着吸），补加200微Trizol，加200微氯仿，静置2—3min。
【5】4°C离心10min  12000rpm/min,此时配胶摆管，分成3相   水相—无色—核酸 ，蛋白相---白色---已变性析出的蛋白  ，有机溶剂相---红色—有机溶剂，杂质。
【6】用200微枪吸出水相，吸400微就够了，不要吸到中间层，把剩下的盖好盖子扔掉。
【7】1：1加异丙醇，一般加450微异丙醇，上下颠倒。
【8】 4°C离心15min  12000rpm/min，底部有极微量白色沉淀---此时配琼脂糖胶，作检测用。
【9】配75%酒精，用无酶水配。根据有多少个管，如需要10毫升：7.5毫升无水乙醇+2.5毫升无酶水。
【10】将上清倒掉，看着管，不要把沉淀倒出来，加1毫升75%酒精，12000rpm  4min离心，摆用于测浓度和跑胶的小管。
【11】把上清倒掉，再离心30s，把液体离至底部，看着管底把液体吸走，在超净台里晾一会。（不太干的话有酒精影响逆转录酶活；太干的话，不好溶也可能降解）。
【12】4—5min后，加20微无酶水溶解（弹几下）
三：逆转录
提取的RNA用5微用于测浓度和跑胶，测浓度是为了做逆转录的时候要算加的体积，跑胶为了检测RNA有没有降解和污染。
我们用的体系是20微，然后RNA的量是不超过2微克。
例如：
Ng/ul        样品/ul         水/ul
183            11                 3.2
265              8                 6.2
模板和水的总体积为14.2微
配mix 5.8ul/管   
RT buffer       2ul
Dntp             0.8ul
Primers       2ul
酶       1ul


PCR仪设定的程序：
25°C      10min
37°C        120min
85°C        5min
12°C            ∞
体积：25微


好了，做完之后你就得到了cDNA了，cDNA 可以做后续实验（具体哪些还请懂的小伙伴们补充一下）
这里我有几个问题，希望大侠们指点一二。
这里的体系20微是固定的么？还是说得参照相关文献?这里的pcr仪温度是固定的么？还是说根据自己的实验不同设置的温度也可以不同？
同时欢迎大家提出你们的问题，共同学习。

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分割线之下，我还是那个待生物如初恋的实验汪~~~~

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