做实验 | 太实用了！流式细胞术通关锦集（上）

幸福侠侣

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流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）能够快速测定细胞悬液中单个细胞的生物学性质，并可以对特定的细胞进行分选收集。广泛用于细胞生物学，免疫学，遗传学，基础医学等领域。

01.用于做Western 或ELISA的一抗可否用于流式细胞术？

看你说明书上是怎么说的了，如果没有说就不可以做流式，需要另外买了。

02.请问流式细胞术单抗直接荧光需要几种对照？

首先确认你用的直标抗体的荧光染料是什么，再确定该抗体的来源种属，选择相应的同型对照。如：你现在想检测小鼠淋巴细胞表面的CD4抗原， 荧光染料为FITC， 抗体来源为大鼠的IgG1亚型， 即Rat anti Mouse CD4-FITC （IgG1）， 你所需要的同型对照就应该是Rat IgG1-FITC， 一般的抗体说明上都会写清。

03.6孔板的细胞量能否做流式呀？

对于6孔板而言，每孔的表面积为10 cm2，依细胞种类不同在长满时达到的数量从5*10的5次方到5*10的6次方不等。6孔板绝对没问题的！甚至24孔板也可以正常做。不过用于调试仪器参数的正常细胞要多准备一些。

04.流式中检测细胞表面和细胞内蛋白表达水平的抗体有何区别？

抗体只是针对相应抗原的，至于是针对胞内还是胞膜对你检测来说并无明显影响，你只需要查清楚到底是针对哪一个部位的抗原的，应该是可以用同一种抗体进行检测的，在流式操作时只需注意：如果是针对胞内，则需要加破膜剂，让抗体能和相应抗原接触，否则就不需要了。




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05.只要是荧光抗体就可以用于共聚焦显微镜吗？

一般情况下都是可以的。但有时候强度不够，需要选择荧光强度大的染料。

06.流式细胞仪检测细胞周期是否需要鸡红细胞作参照？

不用，标准微球做完laser alignment（光路校正）就可以了。尽量把微球的各色CV值控制在1.5以内。

07.流式细胞仪上的FL2-W FL2-A FL2-H 分别是做什么的？

FL2-W是只检测荧光的脉冲宽度， FL2-H是指脉冲高度。通常在做细胞周期分析时应用，用于去除粘连细胞。

08.细胞膜蛋白变化是用流氏检测好，还是要做western?

膜蛋白的提取，好像很费功夫，提取的不好，western结果也就不可信。流式需要的抗体很少，流式能够检测阳性表达细胞的比例，western能对总的表达定量，各有有缺点。

09.培养细胞的bcl-2及Bax蛋白的检测？

首先制成单细胞悬液，PBS洗涤后用胞内染色试剂盒（很多公司都有，其实就是固定剂加增透/打孔剂）进行处理，再进行抗体孵育标记染色，洗涤后上样。

10.如何分选原始红细胞？

CD71（转铁蛋白受体）--幼稚细胞的标记
CD235（GPA）--红细胞的标记（小鼠有Ter119）
双阳性细胞即为幼稚红细胞，但无法区分原始及中晚幼红.



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11.怎样选择流式同型对照？

同型对照（Isotype Control）：使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。如果一抗是多抗，可以用an normal serum（与一抗相同的正常血清） （must be the same species as primary antibody）。This control is easy to achieve and can be used routinely in immunohistochemical staining.这个可以咨询试剂商。同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照。由于荧光标记单抗的组来源不同，应选用相同来源的未标记单抗作为同型对照来调整背景染色。举个例子：比如检测一抗为单抗的mouse anti rat CD11b，clone OX-42 purified IgG，那么它的isotype 是mouse IgG2a， 所以可以用purified（纯化的） mouse IgG2a来做OX-42的同型对照（Isotype Control）。一般的的生物技术公司和国内的代理都有出售。

同型对照：是指与MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亚类，若使用直接免疫荧光染色法，同型对照也应标记荧光色素，如IgG1 FITC、IgG2ａ、PE等。主要考虑了细胞的自发荧光、FC受体介导的抗体结合和非特异性抗体结合等影响因素。此外，同型对照与MoAb所标记的荧光色素、浓度、F：P比值（标记的荧光色素与免疫球蛋白分子的比值）应该相同为最佳，这对准确设定阴性与阳性细胞的界标有重要意义，切忌使用与MoAb不相匹配的同型对照，最好为同一实验室、采用相同工艺或方法制备（如同一品牌）的产品。

12.流式细胞技术测定细胞内游离钙浓度为何要使用氯化钙

在文献及其他专业网站中都有测定游离钙的方法，具体如下：
（1） 钙荧光探针负载；
（2）随机测定每管细胞悬液样品（以下简称样品）的单个细胞的荧光强度，记为F值。
（3）加入10%Triton X 100，（破膜用）；加入1 mmol/L氯化钙，（问题所在），吹打均匀，孵育1~10min，测定荧光即Fmax值。
（4）加入EGTA，20%26mu;l（钙螯合剂），孵育1~10min，激发波长488nm测定荧光，即Fmin值。这个过程中的氯化钙的作用如何， 请高人指点， 谢谢。

因为正常血浆中Ca2＋浓度是1mM，细胞外液的Ca2＋对细胞内Ca2＋有影响。加0.1%triton是增加膜通透性，使细胞外Ca2＋进入细胞内，作为最大值。加EGTA是为了螯合Ca2＋，作为最小值.生理环境中细胞内钙离子浓度远低于细胞外液（大约1：10000），细胞膜对钙的通透性变化对细胞内钙影响很大。

13.流式与werstern的区别有哪些？

（1）Western 是检测蛋白表达的金标准，可用于检测细胞多种类型的蛋白；流式细胞术的方法多用于检测细胞膜蛋白，虽然也可通过Triton-X100给细胞打孔的方法来检测胞内蛋白，但对于分泌蛋白却是无能为力的；
（2）Western测蛋白含量对抗体的量需要很少，一般1：1000左右，而流式对抗体的需要量很大，一般1：50（很浪费抗体）；
（3）采用Western方法检测细胞蛋白含量的变化一般要有内参，而流式一般要把每个样品分为两份，同时都做只加二抗（FITC标记的）的对照，这样平均到每个细胞的发光就不用内参了；
（4）就个人经验而言，流式用多抗不好，单抗标出来不错。

不过流式的应用原理主要还是抗原和抗体反应和western、免疫组化没有本质差别，但是由于免疫组化和western都有酶催化底物的放大体系，因此，流式不适合检测低表达的蛋白，低表达的还是采用western（尤其是化学发光底物更佳）和免疫组化更好。当然，流式最大的一个特点就是，可以定量（百分比），如果是高表达的用流式细胞仪非常有优势。

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