干货分享 | 细胞铺板有哪些被忽略的小妙招？

生物科研实验室

细胞铺板是细胞生物实验起始的重要步骤，可以说是引领着一个细胞实验成败的关键！其基本原理是将一定数量的细胞均匀，密度合适的接种到培养皿中继续培养，以便后续进行一系列细胞实验。
无论是药物筛选、基因表达研究还是细胞信号通路分析，细胞铺板都是实验设计中的关键步骤。正确的细胞铺板可以确保细胞的健康生长和实验的可重复性，从而获得可靠的实验数据。
01细胞铺板实验

一、准备工作
1. 实验材料：细胞培养皿，细胞计数仪，完全培养基，PBS，胰酶，移液枪及枪头等。
 小贴士：完全培养基一般是由无血清培养基+胎牛血清 (FBS) +青霉素/链霉素双抗组成。2. 无菌环境：实验开始前对实验材料进行清洁并无菌处理，如紫外照射。3. 培养基预热：将完全培养基，PBS，胰酶，置于 37℃ 预热至室温，减少细胞冷应激。
二、收集细胞
1. 选择细胞：根据实验需求选择生长速度、形态、特性等合适的细胞系或提取原代细胞。
2. 观察细胞状态：将细胞放置在显微镜下观察其生长状态及密度。以贴壁细胞为例，若培养基澄清透明且无漂浮杂质，当细胞生长至 80-90% 密度且状态良好时，则可以进行细胞传代或铺板。
3. 细胞消化：将细胞进行传代，弃去培养基，取适量的 PBS 轻轻润洗 2-3 次，吸尽上清。加入适量的胰酶置于 37℃ 培养箱中消化 (消化时间根据细胞类型而定)，待细胞皱缩且间隙变大、可从皿底滑落且不聚团成块时即可加培养基终止消化。
三、细胞计数
将终止消化的细胞轻轻吹打，使细胞完全从皿底脱落。将细胞悬液收集至离心管中，以 800-1000 rpm，3 min 进行离心，弃上清。加入适量的完全培养基充分重悬细胞团块，轻轻吹打混匀后取 10 μL 细胞悬液与 10 μL 台盼蓝轻轻混匀，用细胞计数仪进行计数，再根据实验铺板密度的需要计算所需细胞悬液的体积。
四、细胞铺板
▐ 确定铺板密度
1. 不同孔板铺细胞数 (以 HEK 293 细胞为例) 铺板密度
铺板操作确定铺板密度后，根据自己所需的细胞量即可计算所需的细胞悬液体积。举个栗子：若需要 5 mL 密度为 105/mL 的细胞量，细胞计数结果为 2×106/mL，则吸取 250 μL 的细胞悬液与 4.75 mL 的完全培养基混合即可。
用移液枪吸取适量的细胞悬液 (避免吸取气泡)，在培养皿上方竖直悬空均匀、缓慢地滴加在各个角落。盖上培养皿后沿着水平桌面采用“8”字法或者“十字”形轻轻摇晃培养皿，重复 5-6 次确保使细胞均匀分布在培养皿中，然后进行铺板操作[10]。
1. 96 孔板：
充分混匀细胞悬液后 (避免产生气泡)，用排枪吸取计数后一定体积的细胞，枪头与孔壁呈 45 ℃ 沿壁缓慢并均匀地将细胞悬液分配到每个孔中。若加样孔太多，建议每铺一部分及时混匀细胞悬液。在接种完成之后，盖上 96 孔板，静止 3-5 min。
2. 其他孔板或者培养皿：8 字法：以 24 孔板为例，细胞铺完后，贴着水平桌面画 “8” 字轨迹，重复 5-6 次。
十字混匀法：以 24 孔板为例，细胞铺完后，贴着水平桌面先上下移动，再左右移动，呈十字形状，重复 5-6 次。
后续观察铺完细胞后记得显微镜下观察确认细胞的均匀度和密度，如果你能观察到细胞“颗粒”分明、分布均匀且密度中等，那么恭喜你，细胞铺板工作你已经完美结束啦~赶紧将你的细胞放回恒温培养箱中继续培养啦！