怎么分析免疫组化结果？

千姿百态

免疫组化的染色图片有了，怎么在软件上分析目标蛋白的染色数量和各蛋白质间数量的相关性？

原文地址：https://www.zhihu.com/question/356471139

大力水手

刚好在做，写了详细的步骤分享~
一、Image J软件安装看以下文章

ImageJ？Fiji？Image pro plus？图像处理哪家强？（带安装包）

二、Image J定量分析免疫组化图步骤

打开Image J软件，点击【File】-【Open】选择要分析的图片


从文件夹中选择打开待分析的图片。


将图片由彩图转化为黑白图：Image j 菜单栏选择【Image】-【Type】-【选择“RGB stack”】




接下来是【调节对比度】，调节图片最下方的滑轮，调节对比度（一般调节到中间或最右侧）


然后就是调阈值，选中要分析的部分
菜单栏选择【Image】-【Adjust】-【Threshold】




将如下图红框位置中【Default】中选为【“Red”】


用滑轮选中阳性信号区域，看图上全部选上就可以了。


选完之后点击【Set】-【OK】


接下来设置分析结果的参数
菜单栏点击【Analyze】-【Set measurements】


接着选定如下所需参数，选择完参数之后点击【OK】
Area：所框选区域面积
Mean：框选区域平均灰度值
Integrated Density：IntDen，框选区域荧光总强度


最后分析得出结果，菜单栏选择【Analyze】-【Measure】，组化结果就分析出来了


得到的结果包括累积光密度值IntDen（Integratedoption density，IOD）。IOD值与目的蛋白的总量成正比，IOD值除以目的蛋白分布区域面积（IntDen/Area），得到平均光密度值。AOD（AverageOptical Density），通过AOD值作统计图，即可比较蛋白表达量的差异。
公式：AOD（%Area）=IOD/Area
% Area即为我们所需的结果。


三、最全组化实验问题解决方案

免疫组化实验过程包括切片制作（固定，脱水，透明，包埋，切片，贴片，烤片），脱蜡，水化，阻断，抗原修复，封闭，一抗孵育，二抗孵育，显色，复染，封片，分析。
实验过程常见问题如检测结果阴性，非特异性染色，染色强度不够，着色不均，脱片，干片等。
1.标本的固定



问题：
固定不及时或固定不完全，细胞核模糊，对比不鲜明。
建议：

• 组织离体后尽快固定，组织块大小为15×15×5mm，切开固定效果好；
  
• 固定液以10％中性福尔马林缓冲液为佳；
  
• 固定时间在4h-48h之间，长时间固定会影响抗原决定簇的暴露，产生阴性结果；
  
• 固定液的量要超过组织体积5倍以上。
  

2.标本的取材，脱水，浸蜡

问题：
如果组织脱水、浸蜡不充分，蜡块会出现组织收缩凹陷，而且在免疫组化热抗原修复操作时会容易脱片。
建议：

• 梯度酒精脱水尽量彻底充分；
  
• 二甲苯透明时间不宜长，1～3h为佳，透明过度会导致组织发硬发脆；
  
• 浸蜡应选择低熔点的石蜡，浸蜡应充分。
  

3.标本的切片，捞片，烤片



问题：
切片太厚，有刀痕，有褶皱，脱片。
建议：

• 切片厚度视组织而定，如同淋巴结、肾等需要比较薄（不超过3um），脑组织需要较厚（尤其是取新鲜标本冰冻制片时），常规都要6-8um最佳，冰冻可切至10um；其他一般如胃肠道、肝胆等等组织，2-4um均可,太厚易掉片，细胞重叠，影响观察。
  
• 切片角度和刀片新旧程度对切片效果的影响较大，切片角度视切片机型号而异；新刀片容易切出完好的切片。
  

左：乳腺癌组织石蜡切片，Mammaglobin染色阳性，脱片，烤片时间不足。
右：乳腺癌组织石蜡切片，MUC6染色阴性，烤片时间充分。
建议：

• 捞片要求达到无皱折、无气泡，水温宜在40℃左右。
  
• 粘片时需准备蛋白甘油，蛋白甘油由鸡蛋蛋清和甘油调配而成，比例为1：1。 先将一滴蛋白甘油涂抹在干净的载玻片上，然后用载玻片从水中将展好的蜡片捞起，平放入烘箱内进行烘干。或者玻片用防脱片或多聚赖氨酸处理，以增强粘附性。
  
• 烘干温度为50℃，时间为12～24h。
  

4.标本的脱蜡不完全

问题：
脱蜡不全,组织出现异染现象,异染现象一般是苏木素着色不佳,HE染色没有选择性,染色不均匀。有的是伊红染不上。
建议：
根据不同的室温，调节脱蜡的时间，原则上是要彻底、干净、完全地脱去切片上的蜡。
5.抗原修复



相同组织，不同PH抗原修复液修复结果不一样。没有一种抗原修复缓冲液可以适用于所有抗原。
6.封闭



问题：
封闭时间过长，会导致阳性信号减弱甚至出现假阴性。
封闭时间不足，会导致背景增强甚至出现假阳性。
建议：
根据实验实际情况选择合适的封闭试剂和封闭时间。
7.洗涤



问题：
染色液的堆积（黑色箭头区域）。
建议：
充分洗涤。
8.干片



问题：
干片导致的假阴性（黑色箭头区域）。
建议：
加入Tween-20的缓冲液能够更好地防止切片干燥。
9.边缘效应



问题：
边缘效应造成的非特异性染色（黑色箭头区域）。
建议：
组织切片与玻片黏贴牢固，试剂完全覆盖组织防止干片，加入Tween-20的缓冲液能够更好地防止边缘效应。
10.一抗的选择

抗体特异性



左：癌细胞胞浆强阳性，抗体细胞特异性及细胞亚定位染色正确。
右：癌细胞胞膜弱阳性，抗体细胞特异性正确，细胞亚定位错误，该抗体特异性不准确。
问题：
抗体特异性差，定位不准确。
建议：
抗体的特异性是选择抗体最重要的原则，不同抗体特异性不同，组织特异性，细胞特异性，细胞亚定位的特异性需都准确。
抗体的染色强度



左：癌细胞染色胞膜强阳性。
右：癌细胞染色胞膜弱阳性，抗体染色强度不够。
问题：
检测结果会出现弱阳性。
建议：
适当调整抗体稀释比，或者选择染色强度高，高亲和力的抗体
抗体稀释比的影响



左：抗体1:8000稀释，略有背景。
右：调整抗体稀释比例1：30000，背景情况有所改善，抗原染色强度也有所降低。
问题：
染色结果出现非特异性染色或者是低背景。
建议：
当结果出现非特异性染色或者有背景时，可以适当调整一抗的稀释比例进行改善。
一抗孵育条件


左：一抗4°C过夜，癌细胞胞浆强阳性，背景干净。
右：一抗37°C-60min，癌细胞胞浆中等强度阳性，背景干净。
问题：
孵育条件对染色结果有影响。
建议：
选择合适的一抗孵育条件。
11.不同组织的影响



HER-2在4个不同乳腺癌的组织标本上的染色结果不同
问题：
染色结果与预期不符，检测阴性或者弱阳性。
建议：
设置阳性组织切片的对照，因为同一蛋白在不同组织中的表达会有很大的差异。
12.二抗的选择



左：二抗为HRP直标二抗显色，染色结果弱阳性，低背景。
右：多聚物酶标记二抗显色，染色结果强阳性，背景干净，对比明显。
问题：
使用不同的二抗显色系统会出现不同的结果，可能会有弱阳性结果。
建议：
使用多聚物酶标记二抗比普通的HRP直标二抗灵敏度更高，背景更干净，对比更明显。
13.DAB显色

• DAB絮状或团状沉积
  

问题：
产生深棕至黑色的DAB絮状或团状沉积于组织切片上。
建议：

• 现配现用：因为DAB显色液配置好了之后极容易产生DAB的沉积，从而导致样本上会出现深棕色的絮状沉淀，干扰结果的判定。
  
• 显色时间：所有说明书上的显色时间均为一个范围，有的反应迅速的30s-3min，有的反应缓慢的3-20min，应该灵活调整，最好是滴加了DAB显色液后置于显微镜下控制显色时间。
  
• 信号偏弱
  

问题：
信号偏弱。
建议：
适当延长显色时间，滴加了DAB显色液后置于显微镜下控制显色时间。
14.苏木素使用原则

1.不同的苏木素配方的染色时间各有不同，配置的新旧程度染色时间也不同。
2.国际上常用的为Harris苏木素，因为配方中含汞，通常还需要进行分化，返蓝的步骤，但颜色亮丽。
3.改良的Mayer苏木素配方不需要分化，时间可以根据配置的时间调整染色时间15s-2min。





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大力水手

免疫组化简介
免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)技术，是一项利用抗原抗体反应，通过使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对蛋白定位，定性的实验技术。广泛的应用于基础研究和临床病理诊断，在基础研究中可用于确定细胞内抗原，并对其进行定位、定性及定量的分析，在临床病理诊断方面，可用于判断肿瘤的来源、分类和鉴别诊断及评估临床治疗。

免疫组化主要用的是组织标本和细胞标本两大类，组织标本包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片。石蜡切片，对组织形态保存好，保存时间也长，虽然对组织抗原暴露有影响，但可以抗原修复，所以石蜡切片仍然是首选的标本制作方法。



免疫组化是个苦活，耗费时间长，步骤多，还要经常接触有毒致癌物质。想染出了漂亮的片子和实验结果就必须要有正确的实验思路和操作方法。

免疫组化的步骤详解

1、在60°烤箱烤片30~60min，这一步是为了使蜡片水分蒸发和石蜡融化，好让组织切片牢固贴在玻片上。做切片是免疫组化的前提切片子最好是找专业培训郭的人员切片，片子的厚薄均匀，切片的完整，无褶无刀痕。

2、脱蜡水化，依次放入二甲苯I、II、III各10min，乙醇梯度（高至低）各2min，水。然后用自来水洗一下，但不要直接对着切片冲洗。
3、抗原修复，小编用的是高压热修复，ph6.0的柠檬酸盐缓冲液，一定要全部浸泡切片，等高压锅冒气后5min结束，自然冷却，温度剧降可能引起脱片哦。3%H202避光浸泡15min。
4、用免疫组化油笔围绕组织画圈，接下来就能看见它的功效了。PBS洗5min*3次。PBS会被锁在画的圈中，不会流干，保证不干片。

免疫组化结果分析

很多时候，我们千辛万苦地染出了一张张漂亮的免疫组化片子。如何正确地分析，得出理想的结果。
结果分析主要有两种方法：阳性着色细胞计数法和评分法。
前者是在40*光镜下，随机10个视野下计数阳性着色细胞；
后者则是在光学显微镜下按染色程度（0分阴性着色，1分淡黄色，2分浅褐色，3分深褐色）和阳性范围（1分0-25%，2分26-50%，3分51-75%，4分76-100%）评分，最终分数相加。

1.对照染色
没有对照染色的免疫组化结果是不可信的。对照一般有阳性组织对照，阴性组织对照，阴性试剂对照，自身对照。一般来说，有一个阳性组织对照和一个阴性组织对照就足够了。

2.定位
抗原表达必须在特定部位。如LCA应定位在细胞膜上；CK应定位在细胞浆内；PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内等等。不在抗原所在部位的阳性着色，不能视为确切的阳性结果。有可能是非特异性染色或者假阳性。不能确定怎么办？这就要用到上一段提到的对照染色了。

3.肉眼定量
因为人为主观性比较强，所以只能称作半定量。免疫组化的半定量一般就分为三级：弱（+），中（++），强（+++）。以绿色免疫荧光为例，则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光。弱（+）=1，中（++）=2，强（+++）=3。至少随机观察5-10个视野。然后根据（+）% x 1 +（++）% x 2 +（+++）% x 3计算出数值；总数值<1.0者为（+），1.0-1.5者为(++), >1.5者为(+++)。





4.图像分析软件
如果要进行精确定量的话，就要用到图像分析软件，图像分析软件类型很多。Image J为例，一般的免疫组化结果分析用它就绰绰有余了其界面非常简洁，如下图所示：




现在，根据一个实例来看看如何用Image J来进行图像分析。如下图所示，我们有一张细胞的免疫荧光染色的照片。那么，如何用Image J来计数细胞的个数呢？




首先，要把彩色的图像转换成黑白图像。
步骤如下：Image→Type→16-bit。转换成黑白图像后，将要计数的部分用高亮标示出来。
步骤如下：Image→Adjust→Threshold。然后拖动鼠标，直到所有的细胞被标示出来。





有时候2个细胞靠得比较紧密，会被计数为1个细胞。这个时候可以采用Image J的水洗功能。

步骤如下：Image→Binary→Watershed。如下图的蓝色箭头所示，这些是本来计数成一个的细胞，经过水洗之后，更加精确地被计数成2个细胞。





然后，就可以正式开始分析了。
步骤如下：Analyze→Analyze Particles。在得出最后的结果之前，还有一些选项需要选择。
如果想要计数全部的细胞，那么Size项里面选择“0-infinity”。Circularity的默认值为“0.00-1.00”。一般就取默认值。





最后的结果如下图所示。软件自动测量了每个细胞的大小。这里因为是二维图像，所以就是每个细胞的面积。然后计数了一共有72个细胞，总面积为21286.00，平均大小为295.64。



声明：部分图源网络，侵权联删
整合了网上诸多资料，因此未能一一注明出处。如有侵权，请联系作者删除。
捷倍斯公司官网：http://www.gbcbio.cn/
实验所需试剂

货号	试剂名称-(GBCBIO)
T3088	10XPBS Buffer
G0528	4%多聚甲醛溶液|4% Paraformaldehyde Solution
G7224	0.1M柠檬酸抗原修复液|Citrate Antigen Retrieval Solution
G7224S	EDTA抗原修复液(50X)|EDTA Antigen Retrieval Solution
G3433	DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒
G3024	PVP抗荧光淬灭封片液|Polyvinylpyrrolidone Antifade Mounting Medium
G4923	苏木素伊红（HE）染色试剂盒|Hematoxylin and Eosin Staining Kit

卡卡

在上期：IHC之路漫漫（上篇）中，我们的实验达人对在IHC实验中，实验结果如何分析、Triton X-100的使用、如何才能充分脱蜡、一般在什么情况下进行组织抗原修复等问题进行经验总结，接下来我们将继续一抗的选择、如何减少非特异性染色等问题进行学习。
7. 封闭血清该如何选择？



实验中使用封闭血清，以消除非特异性染色，提高目的蛋白的准确性，同时降低背景。
封闭血清一般是和二抗同一来源的，由于二抗大多数是山羊二抗，因此常用山羊血清。有时也会用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗的来源相同。
8. 一抗选择要点



一抗的选择是IHC实验能否成功的关键：

（1）单克隆或多克隆抗体的选择，各有优缺，根据实验目的决定。
一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高。
（2）确定一抗的应用范围
根据自己切片状况（石蜡或冰冻），选择适用IHC的抗体。
（3）一抗的种属来源决定选择相应的二抗
有的抗体可能存在种属差异。
（4）生产厂家的选择
尽量选择可以提供技术支持的制造商，这样可以详细的了解一抗的种属、来源、抗原、质检等信息。
9. 一抗在4℃孵育后为什么要进行37℃复温？

（1）防止脱片
切片如果从4℃取出后直接放入PBS缓冲液中，易发生脱片。
（2）使抗原抗体结合更稳定
对于一些表达较弱的抗原来说，这一步是必需的，在4℃时，抗原抗体分子碰撞几率和运动速率较低，在37℃时，抗原抗体结合更快。但同时也会提高敏感性，造成非特异性染色。
10. 脱片产生的原因以及如何防止脱片？



（1）黏附载玻片质量的问题
（2）组织切的不好，或切片机的问题——如比较钝的刀片切的厚或不均匀、切片者手法不好等
（3）组织问题，比如癌症组织有坏死等
（4）没烤好，时间短或温度不够
（5）操作时甩的太剧烈，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻甩，可用纸从边缘吸水
（6）修复问题：抗原修复时高压时间过长，或者放进修复液时直接丢入等。此外，用EDTA修复比柠檬酸更易脱片。
（7）当见到有组织漂起来时操作更要谨慎，用PBS时尽量用泡的。
11. DAB显色时间如何把握？

（1）DAB显色时间不固定的，主要在显微镜下控制显色时间，到出现阳性部分深棕色，无背景时即可冲洗；
（2）若DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，可能意味着你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短抗体孵育时间；
（3）若短时间就出现很深背景，可能是前面封闭非特异性蛋白不完全，需要延长封闭时间；
（4）DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。
12. 造成切片染色深的因素有哪些？如何才能减少非特异性染色？

（1）抗体浓度过——一抗浓度过高是常见的原因之一
解决措施：每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。
（2）抗体孵育时间过长或温度较高
解决措施：严格执行操作规程，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1H，而是30min，因此，要根据染色结果进行调整。
（3）DAB变质和显色时间太长
解决措施：DAB最好现用现配，如有沉渣，过滤后再用。
配制好的DAB不能长时间存放，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低其效力，因此未用完的DAB存放在冰箱几天后再用也是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想染色程度时立即终止反应。
（4）组织变干——修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等原因造成。
解决措施：操作时要认真仔细，采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。
（5）一抗变质、质量差的多克隆抗体
解决措施：注意抗体有效期，过期抗体会出现不显色或背景着色。



义翘IHC-90001-R002-P53-R002-胃癌-20X-阳

好的实验结果，是发一篇好Paper的重要前提。希望以上经验分享能让大家获得一个好的前提。
篇幅有限，IHC实验过程中肯定还有更多的问题，欢迎大家在文章底部留下你在实验中遇到的难题，我们会邀请有着多年IHC实验经验的大佬们来为大家解答。

继续前进

本回答是关于组化片子如何用Image J 进行阳性信号平均光密度值分析，关于如何用Image J 进行阳性信号面积占比分析见本人另一文章（组化片子如何利用Image J 进行阳性面积占比统计分析）。
1、 打开图片，将图片转换为8-bit格式：Image -> Type -> 8bit。





2、 将灰度值转换为OD值: Analyze -> Calibrate Area -> Uncalibrate OD (滚动条拉到最底) -> OK。OD值单位为Intensity（a.u.）= Intensity arbitrayr unit，即任意单位。







（出现这个曲线图说明转换成功，可以关掉它或者最小化）

3、 设置测量参数: Analyze -> Set Measurements, 勾选Area，Integrated density，Limit to threshold。





4、 选择阳性区域：Adjust -> Threshold -> Auto -> Set -> OK（红色代表选中，选择Limit to threshold只计算红色选择的面积）。





5、 计算结果：Analyze -> Measure（快捷键Ctrl+M）。


平均OD值为IntDen/Area,
所以本图片的平均OD值为: 34074.901/167018 = 0.204.

6、 导出结果：File -> Save as，结果为Excel格式。


如果您觉得这个回答有用，欢迎点赞收藏和转发，谢谢！为了更好地解决大家的问题，本人已开通微信（_17665739136）在线答疑，可语音或者腾讯会议谈论，付费进行，每30分钟50元。
此外，笔者还有其他科研经验和知识文章分享，请需要的人点击以下链接自取：
1、Western blot实验技巧之蛋白样品制备、SDS-PAGE胶制备、跑电泳、转膜、孵育抗体、显影和ImageJ分析（来自一位可稳定重复WB结果的科研狗之四年经验总结）
2、“玄学”实验-Western blot的内参你选对了吗？
3、SDS-PAGE凝胶制备技巧，易翻车点及其解决方法汇总（五年经验结晶）
4、石蜡切片和冰冻切片之高质量HE染色、免疫组化、免疫荧光染色
5、冰切的免疫荧光到底需不需要进行抗原修复？
6、石蜡切片实验中的毒物（苯和二甲苯）与白血病的关系——发病机制
7、一文讲清免疫组化结果到底该选择阳性面积占比，平均光密度值，累积光密度值还是其他分析方法——ImageJ
8、Image J 统计免疫组化片子阳性信号的平均光密度值教程
9、组化片子如何利用Image J 进行阳性信号面积占比统计分析
10、期刊实时影响因子计算（保姆级教程）
11、使用Chat GPT润色英文论文是否会泄露文本，是否符合科研规范，是否增加查重率

长长的路

你相信光吗？




有了光，你才可以拥有五光十色、光彩夺目、流光溢彩、阳光灿烂的的小日子。
科研，同样如此。让我们看看效果：
免疫组化：



免疫荧光：



“光”，让文章充满了美。
但是，现实总是残酷的，总有同学抱怨实验结果不符合预期




下面就跟大家介绍一些小技巧
一、自发荧光
自发荧光是组织/细胞样本在荧光检测过程中产生的与目的信号无关的背景荧光信号。
自发荧光：



自发荧光不是抗原-抗体-荧光团相互作用的特异性着色，其诱发因素有很多：

诱发因素	诱发原因	自发荧光类型
交联固定	醛与胺结合形成席夫碱， 导致自发荧光	蓝色，绿色和红色
内源性物质	血红素	红色
胶原蛋白	蓝光
NADH	蓝光
脂褐素	红光、黄绿光
核黄素	黄绿

下面是避免自发荧光干扰的小技巧，收藏保存转发吧。
自发荧光解决方案：

• 交联固定诱发。使用非醛类固定剂，比如冰乙醇，可有效降低交联固定而诱导的自发荧光。
  
• 红细胞。动物组织取材固定前，先用PBS进行灌注。
  
• 先进行预实验。检测自发荧光的波长范围，再选择与自发荧光荧光信号波长相差较大荧光信号。
  
• 组织自发荧光淬灭剂。自发荧光淬灭试剂中的离子可通过碰撞方式，捕获自发荧光光源分子发出的电子，阻止该电子从激发态回归基态和能量释放，从而淬灭自发荧光。需要注意的是：不同物种不同类型组织的自发荧光具有不同的特征，使用组织自发荧光淬灭剂的效果可能会有差别；另外，淬灭剂会在一定程度上降低抗体荧光强度。
  

• 抗体保存
  

抗体的选择之前我们已经讲过了，但是抗体收到之后也还有一些需要注意的事项。

• 离心。
  

收到抗体，在开盖前先离心。
抗体从离开厂家到送到你手里，经历了很多颠三倒四的“磨难”，抗体有效成分不可避免的会粘附在管盖和管壁上。抗体总量已经很少了（20-100微升），不离心的话可使用量会更少。抗体很贵，要节省哦。

• 储存条件
  

抗体本质上也是一种蛋白，对储存条件也有着严格的要求。
具体方法就是：参考说明书。





注：抗体的有效期储存环境、被取用频率、以及抗体本身稳定性

• 添加剂
  

抗体的储存需要稳定的环境，因此我们可以在抗体溶液中加入不同的添加剂以稳定抗体溶液性质。

• 分装
  

有很多同学喜欢分装抗体，关于这点，我们的意见是：不建议。
分装会降低抗体效价。蛋白质以高浓度保存会更加稳定，抗体溶液体积一般都很小，管壁吸附、水蒸气冷凝会使得分装后抗体的有效浓度降低，效价降低。且分装的体积越小，效价损失越大。