经典免疫检测技术有哪些？

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经典免疫检测技术有哪些？
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细胞免疫检测技术：是指检测参与免疫应答的各种细胞（即免疫细胞）的数量和功能的技术方法。
由于免疫系统或其他系统的疾病，或由于免疫接种或某些临床治疗措施及某些外界环境因素的影响，免疫细胞的数量或功能均可发生变化。因此，进行细胞免疫检测，对于某些疾病的诊断和发病机理研究、免疫治疗或预防接种的效果评估及环境因素对机体免疫功能的影响，都具有重要的意义。
细胞免疫检测的方法很多，可根据要达到的目的和条件适当选用。
一、玫瑰花环试验

70年代初Coombs、 Brain等先后发现人外周血中的T淋巴细胞具有绵羊红细胞（SRBC）受体，在体外的一定条件下，能与SRBC结合形成玫瑰花样的花环，取名为E玫瑰花环试验。E为erythrocyte（红细胞）的缩写。后又发现猪、牛、马、犬、猫、豚鼠等的淋巴细胞与异种动物红细胞也能形成玫瑰花环。
主要概念：
玫瑰花环试验是体外检测人类和动物免疫活性细胞表面标志，从而测定其数量和功能的一组试验方法。


凡能与红细胞形成花环的细胞，称为红细胞玫瑰花环形成细胞（ ERFC ）。
具体应用：
（1）通过玫瑰花环试验，检测淋巴细胞的数量、分布和功能，有助于分析某些疾病的发病机理，推测某些疾病的预后。如结核病，病毒性疾病，恶性肿瘤等疾病过程中，红细胞玫瑰花环形成细胞（ERFC）百分率均降低。
（2）研究化学药物、物理疗法等对机体免疫功能的影响。
（3）筛选免疫抑制性和免疫增强性药物。如免疫缺陷病人经转移因子治疗后，麻风病人经砜类药物治疗后，ERFC百分率升高，表示疗效良好。
1、E玫瑰花环试验

人和动物外周血中的T淋巴细胞在体外能直接和红细胞结合形成玫瑰花样细胞团。这是因为T淋巴细胞上具有能和红细胞上的糖蛋白相结合的受体，称为E 受体。因此E玫瑰花环试验试验可作为外周血T细胞的鉴定和计数，及检测机体细胞免疫功能的一个指标。



反应模式图



反应微观图


一般规定吸附3个以上红细胞的淋巴细胞为E玫瑰花环形成细胞（ERFC） 。


玫瑰花环试验是利用T细胞膜上的红细胞受体，相对定量检测动物血液中T细胞的一种实验方法。
E玫瑰花环试验类型：
T细胞的E玫瑰花环试验在不同试验条件下（孵育的温度和时间）形成的E花环，代表不同性质和状态的T细胞。
总E花环试验——4℃条件下作用2h形成的花环，代表T细胞总数，称为总E花环试验。
活性E花环试验——不经4℃作用，细胞混合后立即反应生成的花环代表T细胞的一个亚群，对SRBC的亲和性高，称为活性E花环试验或早期E花环。
稳定Es花环试验——在37℃下孵育30min形成的花环代表未成熟的稳定T细胞，称为稳定Es花环试验。
Tips：不同种动物的淋巴细胞与红细胞的结合能力不同：
人、猪、牛、羊的淋巴细胞可与绵羊红细胞形成花环。
马、犬的淋巴细胞可与豚鼠红细胞形成花环。
豚鼠、小鼠的淋巴细胞可与家兔红细胞形成花环。


2、EAC和EA玫瑰花环试验

B淋巴细胞表面带有许多标志，如膜表面免疫球蛋白（smIg）、Fc受体、补体C3受体等。
测定smIg的方法较为复杂，要求较高。而测定Fc受体的EA花环试验和测定补体C3受体的EAC花环试验，虽然只能检出大部分B淋巴细胞，但其操作简便，不需要特殊仪器，故使用较为广泛。


（1）EAC玫瑰花环试验
B淋巴细胞上带有补体受体，该受体只能与活化的C3结合。红细胞与相应抗体结合后形成抗原抗体复合物（EA），通过经典途径激活补体，形成活化的C3，然后EA与活化的C3结合形成EAC，EAC上的C3再与B淋巴细胞上的补体受体结合时，EAC 即围绕B淋巴细胞形成花环。
B淋巴细胞有补体受体，而T淋巴细胞无补体受体，故EAC花环试验可用于B淋巴细胞的检测。



E表示红细胞（erythrocyte），A表示抗红细胞抗体（antibody），C表示补体（complement）

（2）EA玫瑰花环试验
B淋巴细胞表面有IgG Fc受体，可与抗原-抗体复合物的Fc段呈牢固结合。绵羊、牛或鸡的红细胞与相应的抗红细胞抗体结合形成EA， EA中抗体的Fc段可与B淋巴细胞的Fc受体形成EA玫瑰花环，以此可计算B淋巴细胞的数目。
Fc受体并非B细胞所特有，中性粒细胞、单核细胞及巨噬细胞表面均有这种受体，但这些细胞可以通过形态学加以区别。
此方法简单，目前较常采用，以检测B淋巴细胞的百分率。




二、性α醋酸萘酯酶测定（酯酶染色法）

T淋巴细胞内含有各种酶类，如酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、酸性α醋酸萘酯酶（ANAE）、β-葡糖苷酸酶、核苷酸酶和转肽酶等。
1975年，Mueller首次报告ANAE活性是小鼠T细胞的特征，其在B细胞则为阴性。
不同类的淋巴细胞所含酶类不同，成熟的T淋巴细胞可显示ANAE活性，这种活性被认为是人和其他哺乳类动物成熟T细胞的一种特征。
在生物学特性上，ANAE是非特异性同工酶，属溶酶体酶系。溶酶体是重要的细胞器，它与一些疾病的发生及转归密切相关。
在生物学作用上，ANAE参与淋巴细胞吞噬消化作用，同时也参与对靶细胞的杀伤作用，并能强化T细胞的某种免疫功能。
1、酯酶染色法基本原理

T细胞的胞浆内存在酸性α醋酸萘酯酶，在弱酸性条件下（pH值5.5～6.5 ），能使底物醋酸萘酯水解，产生醋酸离子和α萘酚，α萘酚与六偶氮副品红偶联，生成不溶性的红色沉淀物，沉积在T淋巴细胞胞浆内酯酶所在的部位。经甲基绿复染后，反应颗粒变暗而呈深紫红色。
2、基本操作过程

（1）静脉采血，肝素抗凝，用聚蔗糖-泛影葡胺分层液分离淋巴细胞，Hanks液洗涤2次后，弃上清，涂片。
（2）干燥后，加1滴2.5%戊二醛4℃固定10min，用水充分冲洗。
（3）干燥后浸入反应液（染色液）内，37℃温育45min至1h，或者室温染色2h，水洗。
（4）干燥后用1%甲基绿复染1min，水洗，干燥，油镜检查，记数。
（5）凡胞浆内有深红色颗粒者为ANAE阳性细胞（T细胞），不同细胞内颗粒大小不等，数量不一。
（6）胞浆内无颗粒者为ANAE阴性细胞（B细胞）。
（7）单核细胞的颗粒呈均匀的红色。
3、应用

正常机体中各淋巴细胞亚群相互作用，维持着机体正常的免疫功能，当不同淋巴细胞的数量和功能发生异常时，就可导致免疫功能紊乱，并可发生一系列的病理变化。
研究表明，T淋巴细胞的数量，在各类临床疾病如自身免疫性疾病、免疫缺陷病、再生障碍性贫血、病毒感染、恶性肿瘤等中都有异常改变。因此，T淋巴细胞数量的检测对了解疾病的发生发展及指导临床治疗都有极其重要的意义。
三、淋巴细胞转化试验

T淋巴细胞在体外培养时，受到特异性抗原或非特异性有丝分裂原（如PHA、ConA）刺激后，可出现细胞体积增大，代谢旺盛，蛋白和核酸合成增加,即向淋巴母细胞转化。
淋巴细胞转化率的高低，可以反映机体的细胞免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。
1、引起T淋巴细胞转化的刺激物



以上刺激因子中，以PHA应用最广，其所引起的转化率大大超过特异性抗原的作用，这种作用与机体是否致敏无关，因此是非特异性淋巴细胞转化试验。
2、临床意义

（1）淋巴细胞转化率的高低反映着机体的细胞免疫机能状态。
（2）细胞免疫缺陷或细胞免疫功能低下者，其淋巴细胞转化率可明显低于正常动物。
（3）患各种恶性肿瘤病时，淋巴细胞转化率可低于正常值。
3、淋巴细胞转化试验操作方法

（1）形态学方法---测定转化的淋巴母细胞百分率。
即在加有PHA的培养基中，培养淋巴细胞后，涂片、染色、镜检，观察形态学变化。
特点：简便易行，无需特殊设备。但重复性、客观性较差。
















（2）3H胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入法-----测定3H-TdR掺入细胞内的相对数量，以确定T淋巴细胞转化率 。
同位素标记物掺入转化法，即当淋巴细胞受分裂原刺激发生转化时，必然伴有DNA的大量合成，此时若将具有放射性的3H-TdR(胸腺嘧啶核苷)加到培养液内，则被摄入到转化中的细胞内，以液体闪烁计数器，测定细胞内放射性物质的相对数量（以脉冲数表示），就能客观地测定淋巴细胞的转化程度。
特点：结果客观、准确、重复性好，但需要一定设备条件。
Note：两种检测方法对比：