流式细胞术检测细胞周期和凋亡

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流式细胞术检测细胞周期：
细胞周期：指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。G0/G1期：有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上无法与G1期区分，细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。S期：DNA开始合成，细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。G2期和M期：当DNA复制成为4倍体时，细胞进入G2期。G2期细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。
PI法是经典的周期检测方法。PI为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。
实验流程：
1  贴壁细胞：
1.1、细胞经过相应的培养刺激后，轻轻去除培养基，加入PBS轻轻摇晃去除PBS；
1.2、加入1ml胰酶，摇晃均匀后放入培养箱中消化（细胞不同消化时间不同）；
1.3、消化结束后，将细胞从培养箱中取出，加入3ml含血清的培养基终止胰酶消化，使用移液器将细胞重悬转移至离心管中；
1.4、1000rpm常温离心5min，去除上清，加入3ml PBS重悬细胞，1000rpm常温离心5min，去除上清，加入75%酒精重悬固定细胞，放入4℃冰箱中固定过夜；
1.5、1000rpm常温离心5min，去除上清，加入PBS洗3次，加入PI染色液，37℃染色30min；
1.6、上流式细胞仪检测。
2 悬浮细胞：
2.1、细胞经过相应的培养刺激后，将细胞和培养基全部转移至离心管中，1000rpm常温离心5min，去除上清；
2.2、加入3ml PBS重悬细胞，1000rpm常温离心5min，去除上清；
2.3、加入75%酒精重悬固定细胞，放入4℃冰箱中固定过夜；
2.4、1000rpm常温离心5min，去除上清，加入PBS洗3次，加入PI染色液，37℃染色30min；
2.5、上流式细胞仪检测。

细胞凋亡：细胞凋亡的早期就有细胞膜表面破损发生。破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸(PS)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。该过程发生在DNA片段化之前，因而检测PS的表达，能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS有很高的亲和性，并且可以与暴露于细胞外的PS相结合。利用这一原理，可以将AnnexinV标记荧光来识别早期的细胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)来区分凋亡和坏死细胞。PI的膜通透性很差，因而只能标记坏死的细胞。
实验流程：
1 贴壁细胞：
1.1、细胞经过相应的培养刺激后，将培养基分别转移至离心管中，加入PBS轻轻摇晃去除PBS；
1.2、加入1ml胰酶，摇晃均匀后放入培养箱中消化（细胞不同消化时间不同，使用中不含EDTA胰酶）；
1.3、消化结束后，将细胞从培养箱中取出，加入3ml含血清的培养基终止胰酶消化，使用移液器将细胞重悬转移至含培养上清的离心管中；
1.4、1000rpm常温离心5min，去除上清，加入3ml PBS重悬细胞，1000rpm常温离心5min，去除上清，加入1×binding buffer重悬细胞，1000rpm常温离心5min，去除上清，重复该步骤一次；
1.5、100μl 1×binding buffer重悬细胞，每个样本加入5μl AnnexinV和PI染色液，轻轻混匀后室温避光孵育15min；
1.6、1000rpm常温离心5min，去除上清，加入500μl PBS重悬细胞，立刻上流式细胞仪检测。
2 悬浮细胞：
2.1、细胞经过相应的培养刺激后，将细胞和培养基全部转移至离心管中，1000rpm常温离心5min，去除上清，加入3ml PBS重悬细胞，1000rpm常温离心5min，去除上清；
2.2、1000rpm常温离心5min，去除上清，加入3ml PBS重悬细胞，1000rpm常温离心5min，去除上清，加入1×binding buffer重悬细胞，1000rpm常温离心5min，去除上清，重复该步骤一次；
2.3、100μl 1×binding buffer重悬细胞，每个样本加入5μl AnnexinV和PI染色液，轻轻混匀后室温避光孵育15min；
2.4、1000rpm常温离心5min，去除上清，加入500μl PBS重悬细胞，立刻上流式细胞仪检测。




图 A 细胞周期检测图；B 细胞凋亡检测图

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