干货：流式细胞术简介 | 流式专题

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摘要：
流式细胞术是一种可对溶液中的单个细胞进行快速筛选和分析的技术。流式细胞仪利用激光作为光源产生散射光和荧光信号，这些信号由光电二极管或光电倍增管等检测器读取。这些信号被转换成电子信号，标准化格式 (.fcs) 数据文件输出。特定的细胞亚群可以基于它们的荧光或光散射特性进行分析并进行分离纯化。
在流式细胞术中可使用多种荧光试剂。这些包括荧光偶联抗体、DNA结合染料、活力染料、离子指示剂染料和荧光蛋白。
流式细胞术是一种强大的工具，可应用于免疫学、分子生物学、细菌学、病毒学、癌症生物学和传染病监测，为免疫系统和其他细胞生物学领域的研究提供了前所未有的细节和分辨率。
在单细胞测序时代，流式细胞仪仍然将发挥其巨大作用。

  1 前言


当单个细胞或颗粒物悬浮在缓冲液中时，流式细胞术可通过单个或多个激光器对这些细胞进行分析。分析每个粒子的可见光散射（visible light scatter）和一个或多个荧光参数。
可见光散射在两个不同的方向上进行测量，横坐标的前向散射光（FSC）可反应细胞的相对大小，而纵坐标的侧向散射光（SSC）则反映细胞内颗粒的大小和多少。
所以坐标图上每一点同时表示具有相应坐标值的细胞存在。光散射与荧光无关。
通过荧光蛋白（如GFP）的转染和表达、用荧光染料（例如碘化丙啶）染色或用荧光偶联抗体（例如CD3 FITC）染色来制备用于荧光测量的样品。
流式细胞术可应用于免疫学、病毒学、分子生物学、癌症生物学和传染病监测等多个学科。例如，它对于研究免疫系统、传染病和癌症等非常有效。它允许同时标记来自血液和骨髓的混合细胞群以及可以分离成单个细胞的实体组织，如淋巴结、脾脏、粘膜组织、实体瘤等。除了细胞亚群的分析，流式细胞术的一个主要应用是分选细胞以进行进一步分析。
用于流式细胞术的仪器在过去几十年中不断发展。多激光系统和专为特定目的而设计的仪器都很常见，后面会进行详细介绍。
过去几年中可用试剂的增加导致流式细胞术实验中使用的参数数量爆炸式增长。用于偶联单克隆抗体的荧光染料显著增加。
此外除了GFP，用于转染的荧光蛋白也有所增加，例如mCherry、mBanana、mOrange、mNeptune 等。荧光染料和仪器的这些进步使得在实际应用过程中的参数超过了30个。


流式细胞术实验的最后一部分是数据分析。传统的二参数直方图设门（gate）和分析仍然被频繁使用。然而，参数数量和实验复杂性的增加使得新的分析算法开始涌现，如PCA、SPADE和tSNE等。
2. 流式细胞仪分类

2.1传统流式细胞仪

传统的流式细胞仪由三个系统组成：流动室和液流系统、激光源和光学系统、光电管和检测系统。
射流系统由鞘液（通常是缓冲盐水溶液）组成，施加压力后将样品输送并聚焦到激光检测器处并分析样品。
光学系统由激发光学器件（激光器）和收集光学器件（光电倍增管、PMT和光电二极管）组成，它们产生用于分析样品的可见光和荧光信号。
二向色滤光片（dichroic filters）将荧光引导至特定的检测器，带通滤波器（bandpass filters）确定读取的光波长，以便检测和测量每个单独的荧光染料。进一步来说，二向色滤光片是使波长较短或较长的光通过并以一定角度反射剩余光的滤光片。
例如，450二向色长通滤光片(DLP)让波长>50 nm的光通过滤光片，并以一定角度反射较短波长的光，然后将其发送到另一个检测器。带通滤波器检测特定波长的光的小窗口。例如，450/50带通滤波器使波长为450 nm +/- 25 nm 的荧光通过滤光片，由检测器读取。
电子系统将来自探测器的信号转换为可由计算机读取的数字信号。450二向色长通滤光片(DLP)让波长超过450nm的光通过滤光片，并以一定角度反射较短波长的光，然后将其发送到另一个检测器。带通滤波器检测特定波长的光的小窗口。例如，450/50带通滤光片使波长为450 nm +/- 25 nm 的荧光通过滤光片，由检测器读取。电子系统将来自探测器的信号转换为可由计算机读取的数字信号。
450二向色长通滤光片(DLP) 让波长超过 450 nm 的光通过滤光片，并以一定角度反射较短波长的光，然后将其发送到另一个检测器。带通滤波器检测特定波长的光的小窗口。例如，450/50 带通滤光片使波长为 450 nm +/- 25 nm 的荧光通过滤光片，由检测器读取。电子系统将来自探测器的信号转换为可由计算机读取的数字信号。
多激光系统对于通常具有20个参数的仪器（FSC、SSC和18个荧光检测器）很常见。有新的仪器平台引入了五个或更多激光器和30-50个参数，但这些不太常见。
传统流式细胞仪中最常用的激光有488nm（蓝色）、405nm（紫色）、532nm（绿色）、552 nm（绿色）、561nm（绿黄色）、640nm（红色）和355 nm（紫外线），额外的激光波长可用于特殊应用。
此外，还有一些仪器用雪崩光电二极管(APD)代替了PMT，用于荧光检测，目的是提高灵敏度。
2.2声聚焦流式细胞仪（Acoustic Focusing Cytometers）

该流式细胞仪使用超声波能够更好地聚焦细胞以进行激光检测。这种类型的声聚焦流式细胞仪允许更大的样本输入的细胞起始量，样本发生堵塞的概率也更小。该流式细胞仪最多可使用4个激光和14个荧光通道。
2.3细胞分选仪（Cell Sorters）

一种特定类型的传统流式细胞仪是细胞分选仪，它可以纯化和收集样品以供进一步分析。细胞分选器允许用户设门（Gate）对所需参数为正（或负）的细胞或颗粒群，然后将这些细胞引导到收集容器中。细胞分选机通过高频振荡液体样本流以产生液滴来分离细胞。然后液滴被赋予正电荷或负电荷，并通过金属偏转板，在那里它们根据其电荷被引导到特定的收集容器。收集容器可以是离心管、载玻片或96孔板/384孔板。有两种类型的细胞分选仪，石英比色皿和“空气激发/喷射”（jet-in-air），它们的不同之处在于激光检测点的位置。石英比色皿细胞分选仪具有固定的激光对准，更容易为分选做好准备。“空气激发/喷射”细胞分选仪需要每天校准激光，设置起来更困难，但更适合小颗粒检测。

2.4成像细胞仪（Imaging Cytometers）

成像流式细胞仪（IFC）将传统流式细胞术与荧光显微镜相结合。允许在单个细胞和群体水平上快速分析样品的形态和多参数荧光（Barteneva et al., 2012）。
IFC可以跟共聚焦显微镜或荧光显微镜一样跟踪单个细胞内的蛋白质分布，也可以像流式细胞仪一样处理大量细胞。
它们在多种应用场景如细胞信号传导、共定位、细胞间相作、DNA损伤和修复以及需要能够协调细胞定位与大量细胞上的荧光表达等。

2.5质谱流式细胞仪（Mass Cytometers）



质谱流式细胞仪结合了飞行时间质谱仪和流式细胞仪。细胞用重金属离子标记抗体（通常来自镧系元素系列）而不是荧光标记抗体进行标记，并使用飞行时间质谱法进行检测。质谱流式细胞仪不具备FSC或SSC光检测功能，因此无法使用常规方法检测细胞聚集体。
此外，质谱流式细胞术没有细胞自发荧光信号，试剂没有与荧光标记相关的发射光谱重叠，因此不需要补偿。
然而，样品在分析过程中会被破坏，因此无法进行细胞分选，并且采集速率远低于标准流式细胞仪。
目前有40个通道的试剂，但随着引入其他金属离子（如铂）与抗体结合，这个数字将会增加（Mei et al., 2016）。
2.6用于微珠矩阵分析的细胞仪（Cytometers for Bead Array Analysis）

多重微珠阵列利用在特定通道中具有已知荧光量的捕获微珠和由单独激光检测的报告分子来量化与特定微珠相关联的捕获分析物的量，相当于100次ELISA检测。已开发了通常带有2个激光器和96孔装载器的小型流式细胞仪来分析这些测定。这些仪器占地面积小，光学平台设计经过优化，可检测和区分沿两个通道具有不同荧光量的珠子。已开发出可检测100-500种不同微珠组合的仪器。2.7光谱分析仪（Spectral Analyzers）

多参数流式细胞术的挑战之一是荧光染料之间的补偿（或消除光谱重叠）。
光谱分析仪是一种新型流式细胞仪，专为解决这一问题而设计。光谱分析仪测量多色样品中每种荧光染料的整个荧光发射光谱。然后在分析过程中，将每个光谱分开，为每个荧光染料提供纯信号(Sony, 2017)。光谱分析开始取代传统的PMT作为高维流式细胞术的检测方法。

3. 可用试剂

3.1有机小分子

luoroscein (MW=389 D)、Alexa Fluor 488 (fluorescein analog)、Texas Red (325 D)、Alexa Fluor 647 (1464 D)、Pacific Blue和Cy5 (762 D)等小分子通常用于抗体偶联。
它们具有一致的发射光谱，但斯托克斯位移很小（激发波长和发射波长之间的差异，大约50-10 nm）。它们也很稳定，很容易与抗体偶联。
3.2藻胆蛋白（Phycobiliproteins）
藻胆蛋白是来自蓝藻、鞭毛藻和藻类的大蛋白质分子。它们是大分子，例如藻红蛋白的分子量为240,000 D。
这些蛋白质具有大的斯托克斯位移(75-200 nm)，并且非常稳定，具有一致的发射光谱。
由于它们的大尺寸，藻胆蛋白非常适合定量流式细胞术，因为它们在缀合过程中通常具有 1:1 的蛋白质与荧光染料的比率。
然而，藻胆蛋白易受光漂白影响，不推荐用于长时间或反复暴露于激发源的应用。藻胆蛋白的例子是藻红蛋白 (PE)、别藻蓝蛋白 (APC) 和 peridinin 叶绿素蛋白 (PerCP)。

3.3量子点（Quantum Dots）




量子点是半导体纳米晶体，具有与纳米晶体尺寸相关的紧密荧光发射光谱。
它们最适合用紫外或紫光激光激发，但也可能被多个激光最低限度地激发。当量子点用于多参数实验时，这种最小激发使荧光补偿复杂化。
由于补偿问题和将量子点与抗体结合的困难，这些试剂在多参数染色面板中已在很大程度上被聚合物染料取代。

3.4高分子染料

聚合物染料由收集光信号的聚合物链组成，可以根据聚合物链的长度和连接的分子亚基“调整”以吸收和发射特定波长的光。
这些染料非常稳定，具有与藻胆蛋白相似的量子效率，但光稳定性大大提高。
由于可以使聚合物染料仅吸收特定波长的光，因此它们避免了多次激光激发导致量子点试剂难以在多参数实验中使用的问题。这些试剂的例子是亮紫(BV)、亮紫外(BUV)和亮蓝(BB)试剂。
3.5串联染料

串联染料将藻胆蛋白（PE、APC、PerCP）或聚合物染料（BV421、BUV395）与小的有机荧光染料（Cy3、Cy5、Cy7）化学偶联，以产生一种染料，该染料使用荧光能量转移(fluorescence energy transfer, FRET)来增加可用的荧光染料可以用单个激光源激发。
例如，德克萨斯红TxRed的最大激发波长为589nm，PE的波长为585nm，因此通过将PE耦合到TxRed，PE的发射光用于FRET激发TxRed，从而允许PE-TxRed被激发488nm或532nm激光。
聚合物链抗体使用相同的方法来增加可由单个激光激发的可用荧光染料。
串联染料非常明亮，具有较大的斯托克斯位移值(150–300 nm)，这在处理低抗原密度时非常有用。然而，串联染料不如供体荧光染料稳定，并且能量转移效率有批次效应，使补偿复杂化。。
3.6核酸染料




核酸染料结合 DNA、RNA或两者。它们用于定量DNA以进行细胞周期分析（碘化丙啶、7AAD、DyeCycle Violet、DAPI）、区分染色体进行分选（Hoescht 33342、Chromomycin A3）、使用侧群分析（Hoescht 33342）分选干细胞、细胞活力和分拣细菌。
它们可以与另一种标记物溴脱氧尿苷（BrdU）结合来确定细胞增殖现象。
3.7 增殖染料

可以通过用溴脱氧尿苷（BrdU）脉冲细胞，然后用抗Brd 的抗体和DNA染料染色来测量细胞增殖。
然而，这种方法不允许进行长期增殖研究。羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)和其他类似染料可用于跟踪增殖细胞的多次分裂。
这些染料的红色和紫色激发变体现在也可用。每个细胞都被染料永久标记，由于染料的稀释，随后的细胞继承了较少量的染料。这些染料不影响细胞生长或形态，适用于长期增殖研究。

3.8细胞活力染料

细胞活力可以通过染料（碘化丙啶，DAPI）或通过染料与细胞内的胺结合来确定细胞膜是否完整来测量。
例如Thermo Fisher的Live/Dead试剂、Zombie染料 (Biolegend)或可固定活力染料Fixable Viablity(BD)等，可以跟细胞内外的胺共价结合，将染色结果在甲醛固定后保留。
通常单细胞核测序中，部分细胞核质量不高或有很多碎片混在测序数据中会导致后期可用数据分析质量较差，若使用流式细胞仪对这些细胞核染色后过滤，则会大大提高后期分析的数据质量。
3.9钙指示染料




钙指示剂染料在与钙结合后会发生颜色变化。它们用于指示细胞激活和信号传导。数据表示为与结合和未结合的钙和染料相关的两个波长的比率。
最常用的染料仍然是 indo-1，一种紫外线双相钙探针。还提供包括fluo-3 在内的蓝绿色钙探针。

4. 应用场景


4.1 免疫学

4.1.1 免疫表型
免疫表型分析是流式细胞术中最常用的应用。它利用流式细胞术的独特能力同时分析混合细胞群的多个参数。
在最简单的形式中，免疫表型实验包括用荧光染料偶联抗体染色的细胞，这些抗体针对细胞表面的抗原。
大多数这些抗原被标记为CD+数字的形式，以便定义针对特定细胞抗原的单克隆抗体。大多数免疫细胞具有特定的CD标记物，将它们定义为一个细胞亚群。
这些细胞标记称为谱系标记，用于定义特定细胞群，以便在每个免疫表型实验中进行额外分析。例如T细胞标记（CD3、CD4、CD8）、B细胞标记（CD19、CD20）、单核细胞标记（CD14、CD11b）和NK细胞标记（CD56、CD161）。
除了定义细胞群的谱系标记外，还使用其他标记来表征每个细胞群。这些标记可以包括激活标记（CD69、CD25、CD62L）、记忆标记（CD45RO、CD27）、组织归巢标记（α4/β7）和趋化因子受体标记（CCR7、CCR5、CXCR4、CCR6）。
通常，免疫表型实验还包括细胞内标记物，例如FoxP3（Treg细胞）、细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-2定义Th1 细胞）、增殖标记物（Ki67、CFSE）和抗原特异性标记物（主要组织相容性或MHC四聚体）。
4.1.2 抗原特异性反应
通过用特定抗原刺激细胞，然后通过MHC多聚体寻找细胞因子的产生、增殖、激活、记忆或抗原识别，可以测量抗原特异性反应。MHC多聚体是MHC单体（MHC-I 或 MHC-II），它们通常被生物素螯合，然后以四聚体、五聚体或十聚体形式与荧光链霉亲和素骨架结合。这些MHC多聚体“装载”了选择的抗原，然后用于与识别抗原的T细胞结合，从而表明对特定抗原的反应水平。这类通常用于疫苗研究。
4.1.3 细胞内细胞因子分析
细胞内细胞因子分析是通过用蛋白质转运抑制剂（Brefeldin A或Monensin）处理细胞2-12h来进行的，这样细胞产生的任何细胞因子都可以在细胞内积聚，从而实现更好的检测。
在此孵育过程中，可以用各种抗原刺激细胞，例如来自疫苗的肽以测量免疫反应。在蛋白质转运抑制剂处理后，对细胞进行活力标记和细胞表面标记染色，然后固定和透化以使用抗细胞因子抗体进行细胞内染色。
4.1.4 细胞增殖分析



细胞增殖可以通过流式细胞术使用几种不同的测定和标记来测量。
这些测定使用不同的方法来靶向增殖相关事件，例如将胸苷类似物 (BrdU)纳入复制 DNA、可遗传永久性染料(CFSE) 的世代跟踪以及增殖相关抗原(Ki67、PCNA)的表达。


增殖相关抗原的表达也可用作增殖的标志物。Ki67 在细胞增殖（所有阶段）期间表达，但不在细胞静止期间表达。
DNA复制需要PCNA（增殖细胞核抗原）。Ki67 或 PCNA 的存在是细胞增殖的指标。
4.1.5 细胞凋亡分析
细胞凋亡或程序性细胞死亡是免疫学和其他研究领域经常检查的一种现象。它用于通过去除细胞而不触发炎症反应（坏死）来维持免疫系统的稳态。
这是免疫反应后克隆扩增的T细胞、自我靶向T细胞、自身反应性B细胞和免疫系统中的多个其他细胞的死亡机制。
通过流式细胞术检测细胞凋亡，利用与凋亡相关的偶联抗体多个目标。质膜的易位是由膜联蛋白V染色的目标，DNA的内切酶消化由一种利用末端脱氧核苷酸转移酶标记与细胞凋亡相关的DNA断裂末端的技术——TUNEL靶向（TdT dUTP Nick End Labeling）测定，胱天蛋白酶的活化可以通过抗体和染料靶向线粒体凋亡由染料靶向，染料可确定线粒体膜电位和通过（Hoescht 33342）染色检测的细胞核中的染色质凝聚。

4.2分子生物学

4.2.1 荧光蛋白分析
荧光蛋白（GFP、mCherry、YFP、mRuby等）用作蛋白质表达的标记。通常，研究人员在细胞中转染的质粒载体往往在启动子序列后面同时加上编码感兴趣基因和荧光蛋白。
荧光蛋白的表达意味着感兴趣基因也表达了。最近，Cre-LoxP技术的出现更是能够实现时空特异性敲除某些基因，并表达GFP等荧光蛋白。这些在特定时间段定向敲除基因的细胞可以通过流式细胞术进行选择性分选。
4.2.2 细胞周期分析
细胞周期分析测定包括用过量的DNA结合染料对DNA进行染色。在大多数情况下，细胞用70%的乙醇溶液固定透化，然后用染料如PI、7AAD、DAPI等染色。
但是，有些染料可以进入活细胞并对DNA染色而不会对细胞造成伤害，例如 Hoescht 33342。在这种类型的分析中，以线性放大的低流速采集样品，然后使用倍性建模软件进行分析以确定细胞周期阶段。
4.2.3 信号转导流式细胞术（Signal Transduction Flow Cytometry）
该应用使用针对静止和磷酸化信号分子制备的抗体。在染色面板中使用这些试剂和专用缓冲液可以研究混合细胞群中的信号通路。
4.2.4 RNA流式细胞术
RNA 流式细胞术将流式细胞术与荧光原位杂交(FISH)相结合，以检测RNA表达和蛋白质表达。
该技术需要染色条件优化，因为并非所有荧光染料偶联抗体都能在40°C下进行多次1h孵育。当抗体无法用于目标细胞识别时，可以在RNA表达时使用FISH技术进行标记。
4.2.5 细胞分选
细胞分选利用具有细胞分选功能的流式细胞仪来分离和纯化细胞或颗粒以进行进一步分析。
本质上，任何可以发出荧光的细胞或颗粒都可以通过细胞分选仪进行分离。细胞可以分选到96孔板或384孔板、离心管和载玻片等容器中。
一些常见类型的样品是表达荧光蛋白的转染细胞、干细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、肿瘤细胞和白细胞群。任何细胞分类的一个主要考虑因素是增加染色大量细胞所需的抗体量。

4.3其他应用

4.3.1 绝对细胞计数
绝对细胞计数利用与样品一起获得的已知浓度的荧光珠对样品进行分析，并将感兴趣群体的门控细胞数量与在同一样品中获得的珠子数量进行比较，以生成每毫升的细胞数量。
4.3.2 定量流式细胞术
定量流式细胞术使用基于微珠的标准来生成已知荧光量的染色曲线。然后使用相同的仪器设置获取细胞，并使用线性回归分析来计算细胞上的荧光量。
最适合此应用的荧光染料是PE，因为它的大小，几乎总是以1:1的荧光染料与蛋白质比率与抗体结合。
可溶性荧光分子当量(MESF) 标准品可用于将任意荧光强度测量值转换为荧光分子的数量，方法是在任何特定实验中生成标准曲线。
4.3.3 多重微珠阵列检测
多重微珠阵列检测是用针对特定可溶性蛋白质或核酸的抗体包被的微珠组。
每个珠子都有一个已知量的荧光和一个特定的目标，它给出了珠子在矩阵中的位置。多达100个微珠的集合与感兴趣的样品一起孵育，然后在流式细胞仪上采集，至少用2个激光检测2种不同的荧光染料。使用特殊软件根据荧光计算分析物的量。
4.3.4 吞噬作用测定
使用荧光标记的生物颗粒或细菌，可以使用流式细胞术检测吞噬作用。
细菌用pH敏感染料标记，只有在暴露于吞噬体的较低pH值时才会发出荧光，表明细菌被吞噬了。
4.3.5 小颗粒分析与分选
使用灵敏度更高的流式细胞仪，可以检测和分选外泌体和其他亚微米颗粒。
细胞外泌体、病毒和其他亚细胞颗粒的分析在多个领域创造了新的应用，包括癌症生物学、癌症治疗和疫苗开发。
该技术仍处于开发阶段，但技术和仪器正在迅速改进，以便在不久的将来更容易使用该应用程序。

5. 数据分析

5.1FCS 3.1文件标准

FCS文件格式创建于1984年，是标准化流式细胞仪的数据文件格式。所有流式细胞术数据文件都具有“.fcs”文件扩展名，允许任何流式细胞术分析程序读取文件。当前的fcs文件标准是 FCS 3.1。
除了仪器提供的软件外，还有多种商业计算机程序可用于分析流式细胞术数据。最受欢迎的是 FlowJo、FCS Express、WinList、Kaluza 和 WinMDI。

5.2 细胞周期分析

细胞周期分析软件程序使用倍性建模来确定DNA 直方图表示的细胞周期阶段。ModFit LT是专用于此类分析的软件。此外，FlowJo软件上还提供了一个细胞周期分析模块。
5.3高维数据分析

使用传统的流动门控策略分析既麻烦又耗时，还可能会错过感兴趣的细胞亚群，因为使用传统的门控方法不容易确定标记之间的关系。
有多种新的分析工具可用于可视化和分析此类数据如SPADE、tSNE、PCA和FLOCK。
tSNE在算法上与PCA相似，但它可以识别出比PCA更多的共分离特征，因为tSNE仅优化了相似对象之间的聚类，而PCA优化了相似事件的接近度和不同事件的分离。
这些算法中的大多数都需要对数据进行降维，以在分析之前降低数据的复杂性。
Cytobank是基于云的高维数据分析的另一款在线应用，用户上传数据并进行分析均在云上操作。tSNE可作为FlowJo 和FCSExpress软件的插件使用。

6. 参考文献：
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3. Leipold MD, et al. Multiparameter Phenotyping of Human PBMCs Using Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 2015;1343:81
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