western blot电泳液可以重复用吗？

幸福侠侣

western电泳液可以重复用吗？和新的电泳液比有什么区别？
hello，这里是个刚刚进入实验室的本科小菜鸡。在度娘之类都没有搜到很好的回答，所以来问各位大佬，结果一时兴起给忘记了当时还发了一个问题。
看了一下，各个实验室的实验内容和用品都不太一样。所以这个问题问的还是蛮没有技术含量的( •︠ˍ•︡ )。
感谢各位大佬们百忙之中对一个小菜鸡的回答呀。

原文地址：https://www.zhihu.com/question/461547147

感恩由您

蛋白质分子由氨基酸组成，在蛋白质分子中保留着游离的末端α-氨基和α-羧基以及侧链上的各种功能团。因此蛋白质的化学和物理化学性质有些是与氨基酸相同的，例如，侧链上功能团的化学反应，分子的两性电解质性质等。
蛋白质也是一类两性电解质，能和酸或碱发生作用。在蛋白质分子中，可解离基团主要来自侧链上的功能团。此外还有少数的末端α-羧基和末端α-氨基。如果是缀合蛋白质，则还有辅基成分所包含的可解离基团。
蛋白质分子可解离基团的pK a 值，它们和游离氨基酸中相应基团的pka值不完全相同，这是由于在蛋白质分子中受到邻近电荷的影响造成的。


蛋白质分子在溶液中受到强大的离心力作用时，如果蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会沉降。沉降的速率与蛋白质分子大小和密度有关，而且与分子形状、溶液的密度和粘度有关。
蛋白质溶液在平衡时，虽然它的分子仍处于不断的热运动中，但是分子在整个溶液中的分布在统计学上是均匀的。如果分子在蛋白质溶液中造成浓度差，例如小心地把纯水放在蛋白质溶液的上面，则蛋白质分子将从下面的高浓度区向上面的低浓度区迁移，直至达到平衡为止。这时，蛋白质分子将均匀地分布在整个溶剂系统中。 由于浓度差引起的这种溶质分子的净迁移称为平移扩散或扩散。扩散的热力学驱动力是墒的增加。
溶质的扩散速率可依菲克(Fick)第一扩散定律计算，即在dt时间内通过面积 A所扩散的溶质量dm与该处的浓度梯度dc/dx成正比：


比例常数D为扩散系数，它在数值上等于当浓度梯度为一个单位时，在一秒钟内通过1cm2面积所扩散的溶质量。因为扩散是向低浓度方向进行，所以在公式右边一项的前面加上一个负号。扩散系数的单位为cm2·s-1。蛋白质的扩散系数与分子大小和形状以及溶剂的粘度有关。 测定扩散系数主要是基千菲克第二扩散定律：


积分上式得：


扩散系数随Mr 的增加而降低。但扩散系数对Mr的变化并不敏感。对球形的大分子来说，扩散系 数与Mr的立方根成反比。扩散过程是受到蛋白质分子与溶剂之间的内摩擦阻力所反抗的，因这种阻力的大小不仅取决千蛋白质分子的质量，并且强力地取决于它的颗粒形状。
扩散系数随Mr的增加而降低。但扩散系数对Mr的变化并不敏感。对球形的大分子来说，扩散系数与Mr 的立方根成反比扩散过程是受到蛋白质分子与溶剂之间的内摩擦阻力所反抗的，因这种阻力的大小不仅取决千蛋白质分子的质量，并且强力地取决于它的颗粒形状。
蛋白质颗粒在各种介质中包括在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率决定于它所带的净电荷以及分子大小和形状等因素。 1967 年 Shapiro 等人发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加人阴离子去污剂十二皖基硫酸钠和少量琉基乙醇，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与原来所带的电荷和分子形状无关。
SDS 是一种有效的变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用，而β-巯基乙醇能打开二硫键，因此在有 SDS 和β-巯基乙醇存在下，单体蛋白质或亚基（寡聚蛋白质解离成亚基）的多肤链处于展开状态。 此时SDS以其经链与蛋白质分子的侧链结合成复合体。 在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比为1.4 克 SDS/1 克蛋白质，相当于每两个氨基酸残基结合一个 SDS 分子。 SDS 与蛋白质的结合带来了两个后果：
A．由于SDS是阴离子，使多肤链覆盖上相同密度的负电荷，该电荷量远超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别，结果所有的SDS-蛋白质复合体，电泳时都以同样的 电荷／蛋白质比向正极移动。 SDS凝胶电泳可看成是以电场为驱动力代替溶剂流动（重力场）为驱动力的凝胶过滤。
B．改变了蛋白质单体分子的构象，SDS —蛋白质复合体在水溶液中的形状被认为是近似雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合体的短轴长度（直径）都是一样的约为 1.. 8 nm，而长轴长度则随蛋白质的相对分子质量成正比例变化。 不过SDS－蛋白质复合体的真正本质尚不十分清楚。
由于不同蛋白质的 SDS复合体具有几乎相同的荷质比，并具有相同的构象，因而它们的净电荷量(q) 与摩擦系数(f)之比(qf)都接近一个定值（具有相近的自由迁移率），即不受各种蛋白质原有的电荷、分 子形状等因素的影响。 然而在聚丙烯酰胺凝胶中由于引入凝胶的分子筛效应，电泳迁移率与多肤链分子量的对数有下列关系：


或


式中Mr为相对分子质最，a、b和K1、K2都是常数，μR是相对迁移率：


生物学领域的每次重大发现和突破，几乎都离不开物理、化学，很多生物学研究技术和使用工具也都是物理、化学领域的人提出和改进，搞生物的同时多学点物理、化学知识，能帮助我们更好的开展试验。

清风寡欲

关于Western blot详细原理我之前已经介绍过啦，参考下文。
老萌妹儿：如何做Western Blot？|带你3分钟了解Western Blot原理SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳
一、原理：
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质，采用非连续电泳系统，并引入变性剂SDS及还原剂以致蛋白样品最终仅依赖于分子量大小被分离的一种电泳方法。SDS-PAGE有三种效应：1.电荷效应（SDS与蛋白结合形成SDS-蛋白复合物，带有大量的负电荷，使在跑电泳产生的电泳迁移率仅仅取决于蛋白的分子量），2.分子筛效应，3.浓缩效应（浓缩胶与分离胶中聚丙烯酰胺的浓度及pH值不同，即不连续性所致）。
二、步骤：
A. 将玻璃板洗净晾干后将两层玻璃板夹紧对齐放在制胶架上，然后用ddH2O冲洗并测试有无漏液，然后将ddH2O倒掉晾干备用。
B.制胶流程(以一块0.75/1.0/1.5 mm的mini胶为例)我们用的雅梅凝胶快速试剂盒。
1. 取等体积 下层胶溶液 和 下层胶缓冲液 ，各2.0/2.7/4.0 mL，混匀；
2. 向步骤1的混合溶液中加入40/60/80 μL的 改良型促凝剂 ，混匀；
3. 将步骤2的混合溶液注入制胶玻璃板中，使液面和短玻璃板上沿之间的距离比梳齿长0.5 cm即可(注意：此溶液为过量，请勿全部注入，可留少许于配胶杯中，以判断胶凝固状况)，加入适量无水乙醇覆盖于下层胶之上；
4. 待下层胶凝固后(约15 min)，倒去上层无水乙醇；
4. 注意：当无水乙醇和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝固，或者看胶杯中残余的胶是否凝固。
5. 取等体积 上层胶溶液 和 彩色上层胶缓冲液 ，各0.5/0.75/1.0 mL，混匀；
4. 注意：使用前请摇匀。
6. 向步骤5的混合溶液中加入10/15/20 μL的 改良型促凝剂 混匀；
7. 将步骤6的混合溶液注入制胶玻璃板中，插入梳齿；（注意避免产生气泡）
8. 待上层胶凝固后(约10~15 min)，拔去梳齿即可用于电泳。
上层及下层胶均可事先配好，可放于1X的电泳液中密封避光存放于4℃冰箱，可至少存放1周。
三、跑胶与转膜
（一）跑胶：
1. 蛋白样品准备：取一些之前做蛋白提取定量后已知浓度的蛋白样品，将所有蛋白样品调至等浓度（我们一般加入适量的RIPA），充分混合后，将样品与5X的loading buffer按4：1比例混合，并置于沸水中煮5min使蛋白变性，冷却至室温后放冰上备用（上样总体积一般不超过15ul，加样孔的最大限度可加20ul样品）；
2. 将胶连同玻璃板放置于电极架上，（梳子的一面朝里）固定好放入跑胶的缸子里，倒入一些running buffer；
3. 小心拔出梳子，避免破坏胶孔；
4. 上样：每块胶选1个孔加入5ul marker，加样一定要缓慢、稳，尽量选中间孔加入蛋白样本，尽量避免产生气泡，如果每个蛋白样本上样体积差异较大，可用1Xbuffer增加体积较少的孔，避免孔重差异导致相邻两蛋白条带的长短不一，上样完成后再加入一些1X的running buffer；
5. 电泳：连上电极，黑----黑，红----红，先开70v试跑，待样品进入分离胶后电压改为100v，（根据你蛋白样本分离情况调整时间），或当溴酚蓝接近或刚出胶底部时候可终止电泳；
(二) 转膜

1、物品准备：转移缓冲液（Tris5.8g 甘氨酸2.9g SDS 0.37g 甲醇200ml V=1L）、转膜用的夹板、两块海绵垫、4-6张滤纸、一张PVDF膜。
2、剪切适合大小的膜，放在甲醇溶液中浸泡，滤纸和海绵垫提前放入transfer buffer中浸泡；
3、三明治夹板：先在托盘中倒入适量transfer buffer,然后依次放入转膜夹子---海绵垫---滤纸---PVDF膜---胶---滤纸---海绵垫，三明治夹板制作过程中一定要避免产生气泡，一定要充分排出气泡（我们一般会提前将膜跟胶裁剪成合适大小），使夹板夹紧，保证对凝胶有一定压力。
4、将夹子放入转移槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面，并加入适量transfer buffer，对侧插入冰块，并加入一些甲醇，使蛋白与膜更好的结合，插上电极低温转膜（我们埋在冰里开转。。。），选择100v 100min；
5、封闭：转好膜后，将膜正面朝上在1xTBST溶液中摇床上摇动五分钟，共洗3次，移至含有封闭液（含10％脱脂奶粉的TBSB缓冲液或者locking buffer中在室温下摇床上摇动封闭，注：10%脱脂牛奶一般需要封闭1-2小时，locking buffer封闭15-40min；
蛋白与膜结合，增加转膜效率。
注意事项
（1）转移缓冲液必须现用现配。甲醇对于维持转膜过程中膜的极性很重要，利于蛋白与膜结合，增加转膜效率。转膜缓冲液配制时间过长，甲醇会挥发，浓度降低影响转膜效果。
（2）对于大蛋白而言，其在凝胶电泳分离迁移较慢，而从凝胶转出也非常慢，因此，对于这种大分子量蛋白，应该用低浓度的凝胶，8％或更低。但因低浓度的胶非常易碎，所以操作时需十分小心。
（3）降低电转移缓冲液中甲醇的比例以促进凝胶的膨胀，易于大蛋白的转出。
（4）使用硝酸纤维素膜或PVDF膜进行转膜之前，必须用无水甲醇对膜进行活化。
（5）由于Western blot 检测方法非常灵敏，手指上的油脂与蛋白会封闭转膜效率并易产生背景污斑。因此，在操作中尽量避免用手直接接触膜，应使用镊子夹取膜及滤纸的边缘。
（6）排列三明治时，尽量用移液器或15mL试管赶除胶与膜之间的气泡，或将三明治放在装有缓冲液的培养皿中以防止气泡产生，必须戴手套。
（7）确认裁剪的膜和滤纸与凝胶尺寸相同，否则会导致电流不能通过膜，从而转膜无效。
（8）蛋白转印至固相载体（硝酸纤维素膜或PVDF膜等）后，需要与一抗及二抗杂交，为防止一抗和（或）二抗与膜的非特异性结合而产生高背景，必须对膜进行封闭。
四、加抗体及显影
1.加一抗：根据你的实验目的及一抗说明书配制一抗，将封闭好的膜用TBST溶液在摇床上洗膜3次，每次5min,加入5ml配置好的一抗溶液，室温2小时或者4℃低温摇床过夜；记得要回收一抗，放4℃冰箱可重复使用；
2.加二抗：回收完一抗后，将膜用TBST溶液在摇床上洗膜3次，每次10min，加入二抗稀释液（二抗：TBST=1：2000），室温摇床1小时，再用TBST溶液在摇床上洗膜3次，每次10min；
3.显影：洗膜后加入ECL显色剂（溶液1：溶液2=1：1），2min后可显影，记得保存图片。
注意事项
抗体杂交过程涉及一抗和二抗杂交时间、抗体的浓度等关键因素，注意事项如下。
（1）一抗的选择优先选择单抗，一抗的初次实验浓度参考抗体说明书建议的稀释倍数，一般选择中值即可。如说明书推荐稀释倍数为（1：100）～（1：1000），初次可采用1：500。一抗浓度过高会导致非特异性条带产生。
（2）对于蛋白浓度较低的样本，可以通过适当增加上样量或增加一抗浓度，提高检测灵敏度。
（3）一抗的孵育时间可从几小时至过夜（一般不超过18h）不等，具体取决于抗体与蛋白的亲和性和蛋白的丰度，建议使用较高的抗体稀释倍数和较长的孵育时间来保证特异性结合。如果在封闭液中孵育一抗过夜，应在4℃进行，否则会产生污染而破坏蛋白（特别是磷酸基团）。孵育一抗时需保持适当的摇动使之均匀覆没膜，防止结合不均匀。
（4）二抗浓度的选择参考一抗的选择方法，二抗浓度过高或孵育时间过长会导致背景加深并产生非特异性条带。二抗通常在室温条件下孵育1h即可。

长长的路

我看一些博主写了一些各类western转膜条件的经验, 非常值得借鉴,但是我想纠正一些说法,比如转膜液现配现用,用完倒掉什么的, 最多本能用超过3次什么的, 我本人是不赞同的,首先我自己配的电转液就用了超过3次,该有结果的还是有结果,没结果的还是没结果, 其次别人的研究论文都验证了转膜液Transfer Buffer至少可以使用7次以上.
J Biomol Tech. 2009 Apr; 20(2): 93–95.

PMCID: PMC2685604
PMID: 19503619
Transfer Buffer Containing Methanol Can Be Reused Multiple Times in Protein Electrotransfer

Colin J. Pettegrew,* Renuka Jayini,* and  M. Rafiq Islam

因此, 转膜液不需要现配现用,4°保存可以反复使用至少7次, 对WB的结果不起决定性作用. 现配现用,用完倒掉会造成严重的环境污染.

同花顺

可以重复使用，但最好3-5次就更换。也可以一次性使用，推荐在土豪实验室内操作。

卡卡

可以的用个五六次没什么问题。没杂质就行