【Western-Blotting】WB样品准备

大v

在谈WB样本准备之前，笔者想简单回顾一下蛋白质的结构与基本特性。
蛋白质是由许多氨基酸通过肽键、氢键、二硫键等分子间的相互作用力在空间中通过折叠、扭曲等形式相互结合形成的生物大分子，其分子结构可分为一级、二级、三级和四级结构，后三者统称为蛋白质的高级结构或空间结构。1）蛋白质的一级结构是指N-端至C-端的氨基酸排列顺序。2）蛋白质的二级结构是指蛋白质分子中某一肽链的局部空间结构，也就是该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象。3）蛋白质的三级结构是指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，也就是整条肽链所有原子在三维空间的排布位置。4）蛋白质分子中各个亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。
笔者在前面的有关抗原、抗体制备和生产工艺中提及，生产抗体的免疫原多为多肽链，这也可以从各大抗体生产公司的抗体相关信息栏查到（图1）。因此，要想能准确、高效地检测特定的蛋白，在WB蛋白样本准备时需要将蛋白质变性，即从组织和细胞中提取出来的天然蛋白（三、四级结构），变性成为多肽链（一、二级结构）。蛋白质变性主要发生二硫键和非共价键的破坏，并不涉及一级结构中氨基酸序列的改变。若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，有些蛋白质仍可复性，恢复或部分恢复其原有的构象和功能。



图1 Abcam公司货号为ab228466的PTEN抗体的免疫原信息

因此，WB蛋白样本准备中最常用的是热变性（95-100℃，5min），并在加用上样缓冲液（loading buffer）。Loading buffer分还原型和非还原型，还原型loading buffer多加有β-巯基乙醇等还原剂，能抑制或者破坏二硫键等的形成，能够更好地维持蛋白质的一二级结构。因此，还原型loading buffer效果更好，更受研究者欢迎。
在实际操作中有的朋友，存在一些疑问：
1）新鲜标本（组织/细胞）和冰冻标本哪个更好？
首先，新鲜标本优于冰冻标本，实验结果更可靠；在组织/细胞冻存过程中（即使是-80℃），组织/细胞内地各种酶（磷酸酶、蛋白水解酶等）仍可十分微弱地作用，而引起蛋白降解，此外，蛋白也可能发生自发降解。
2）组织/细胞十分珍贵，无法总是实验新鲜标本？
这种情况，别无选择，只能冻存组织/细胞，在此笔者推荐使用加用了蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的蛋白裂解液保存标本，即把蛋白裂解液和组织/细胞均匀混合后（无需彻底裂解）冻存于-80℃冰箱中。
3）冻存组织/细胞、裂解后的蛋白、变性后的蛋白，哪个更好？
变性后的蛋白存放于-20℃中保持相对稳定，可用于多次WB实验；同等条件下，裂解后的未变性蛋白的稳定性要差一些；而每次做WB实验都得重新从新鲜/冰冻标本中准备蛋白样品，虽能保持更佳的蛋白质量，但耗时耗力。冻存变性后的蛋白用于后续多次的WB实验，使用最为广泛。

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