免疫荧光实验常见问题之背景染色太强篇

笑看风云

组织切片太厚：这种情况下可以选择将组织切片变薄试试。

封闭不佳：封闭的目的就是为了减少非特异性的结合，减少背景染色。如果背景太强，可以考虑换种封闭液或者增加封闭孵育的时间

二抗有非特异性结合：要想验证是否如此，可以在染色过程中做个只加二抗的空白对照(也就是说不用特异性的一抗进行一抗的孵育过程，比如用一抗稀释液进行孵育一抗的步骤). 如果空白对照有染色，说明二抗有非特异性结合，这时候建议更换一种二抗。

自体荧光：想知道组织是否有自体荧光，查看在非染色区域是否有荧光即可。有些自体荧光来自固定步骤，可以避免使用戊二q固定，或者使用含0.1% 氢p化钠的PBS洗涤以除去游离的醛基。还有些荧光来自内源性的荧光分子，可以用苏丹黑/硫酸铜进行光漂白。

抗体浓度太高：降低所使用的抗体浓度或调整孵育时间。
洗涤不充分：染色有很多步骤，其中又包括很多洗涤的步骤。在实验过程中，确保洗涤到位，不要偷工减料。

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