免疫组化抗原修复缓冲液 是做什么用的？

Rose

不懂就问  感谢扫盲
如题 “免疫组化抗原修复缓冲液”原本的用途是什么？食药监官网先是的成分 就是柠檬酸 柠檬酸三钠。这东西注射到皮肤有什么危害吗？为什么会有“填充”的效果？
感谢！

原文地址：https://www.zhihu.com/question/435185850

队长是我

抗原修复是公认的免疫组化比较关键的一个步骤，因为我们多使用福尔马林或多聚甲醛溶液来固定组织。甲醛与蛋白质发生交联反应，覆盖抗原决定簇，极大的影响了我们的实验结果，甚至出现假阴性的现象，下面捷倍斯生物通过几个问题，带领大家去认识抗原修复。



图源：bbs.91360.com

Q1：为什么免疫组化要做抗原修复？
A：在免疫组化过程中会对样品材料进行固定，一般常用的就是福尔马林或者多聚甲醛溶液。科学研究已经证明甲醛的醛基与蛋白质发生交联反应，不同程度的遮蔽了抗原表面的抗原决定簇，影响其与抗体结合。其发生交联反应形成的究竟是什么还没有定论，有人说形成的是醛基，有人说形成的是羧甲基。但不管是什么，都会使抗原表面的决定簇减少，影响实验结果，甚至产生假阳性。当然如果使用的是一些其他的固定液（非醛类）就不用抗原修复了。
Q2：如何获得理想的抗原修复结果？
A：主要有两方面：一是抗原修复方法的选择和修复液的搭配；二是操作人的手法和对实验的理解程度。
总的来说，是个搭配并且需要摸索的过程。需要把握的是抗原修复的实质是选对方法，然后用高压或者微波加热的手段打开甲醛与蛋白质的交联，也就是打开化学键的过程，你只要选对方法，通过温度和时间的改变来控制强度，试验并没有想象的那么难。
Q3：所有经过甲醛或多聚甲醛固定的组织都要进行抗原修复么？
A：绝大部分用甲醛固定的组织都需要进行抗原修复，但是也有例外。例如："不同抗原修复法对免疫组化HBcAb染色实验"结果恰恰是不修复的切片染色效果最好。推测的原因是HBcAg是乙肝病毒的壳结构蛋白，并非肝组织本身的，因而甲醛并不一定封闭它。相反的是如果你进行高压热修复，反而会让未被封闭的蛋白变性，那实验结果可想而知。（学术就是这么神奇 哈哈！）
Q4：抗原修复的方法有哪几种？
A：抗原修复的方法主要分为三大类：压力热修复法，微波热修复和酶消化法
压力热修复法
真空负压抗原修复法：
① 切片脱蜡至水。
②0.3%H2O2甲醇真空负压处理5分钟。
③自来水洗，蒸馏水洗。
④0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），真空负压干燥箱预先调至95℃，真空负压处理10分钟。
⑤待修复注降至室温的一，PBS洗3次，随后按选好的年免疫组化染色方法进行染色。这是一种操作简单，效果特佳，温度恒定，能一次性处理大量切片的方法。
高压抗原修复法：
①切片脱蜡至水。
②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。
③自来水洗，蒸馏水洗。
④切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续1－4分钟。
⑤待修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。
隔水热抗原修复法：
①切片脱蜡至水。
②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。
③自来水洗，蒸馏水洗。
④切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）中，边同容器一起放入水溶锅中加热，其间应不断用温度计测其温度，待抗原修复液的温度达到有效温度后（92℃↑）。即开始计时，持续40分钟。⑤待抗原修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选定好的免疫组化染色方法进行染色。
电炉加热抗原修复法：
①切片脱蜡至水。
②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。
③自来水洗，蒸馏水洗。
④ 将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时用温度计测量温度，当达92℃后，即可拔离电源，当温度低于92℃时，再插上电源，如此反复持续至10分钟左右。
⑤待抗原修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选定的免疫组化染色方法进行染色。对各种抗原修复方法的评价。
微波热修复
微波辐射抗原修复法：
①切片脱蜡至水。
②0.3%H2O2甲醇处理10分钟。
③自来水洗，蒸馏水洗。
④ 0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），于微波炉内微波辐射10分钟，如检测Er和Pr则需要20辐射分钟左右。
⑤待修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。
酶消化法
酶消化法:
对某些细胞内抗原（如Fas、Bax、FⅧ等）和细胞间质抗原（如Laminin、CoIV等）则需要用酶消化法处理切片。用于IHC消化的酶很多，所选酶的种类，使用的浓度，PH值，消化时间及温度等均要视组织固定的不同，所检测抗原的性质、组织类型的不同而异，应通过预实验摸索定。
使用酶消化的原则：胰蛋白酶和蛋白酶K一般用于细胞内抗原，如Keratin，CEA，GFAP等。一般说来，胰蛋白酶消化能力较胃蛋白酶弱，主要用于细胞内抗原的消化，胃蛋白酶主要用于细胞间抗原的消化，如fibronectin，Laminin，各型胶原等。消化时间和组织固定的长短呈正比。在用酶消化，热修复后均不能获得结果的前提下使用抗原修复与酶消化结合的方法，有时会取得较为满意的结果。一般蛋白酶K和微波相结合，但应注意，可能检测的抗原无论何种性质均会在核内出现假阳性反应。以高压加热方法、微波加热方法较为稳定,?高压加热方法效果优于微波加热方法和单纯加热方法。溶液的浓度对修复效果无任何影响，而PH值则影响较大。缓冲液以柠檬酸缓冲液和Tris-HCL较常用。
Q5：如何选择抗原修复的方法？
A：我们针对不同的抗原，采取不同的修复方法，取得较理想的染色效果。常用的免疫组化抗原修复主要有微波加热修复法、高温高压修复法和酶消化修复法等方法，抗原修复液主要是枸橼酸盐缓冲液（pH=6.0）和EDTA缓冲液（pH=8.0 pH=9.0）。
抗原修复的方法选择，我们首先看抗原的定位，是位于细胞膜、细胞质还是细胞核。这三个位置的抗原修复难易程度排序：细胞质抗原>细胞膜抗原>细胞和抗原。
可能用得到的产品

货号	产品名称
0685	Pepsin 1:3000, Porcine Source 胃蛋白酶 1:3000
P3440	Proteinase K, Tritirachium Album 蛋白酶K
G7224S	EDTA Antigen Retrieval Solution EDTA抗原修复液(50X)
G7224	Citrate Antigen Retrieval Solution 0.01M柠檬酸抗原修复液

Q6：免疫组化抗原修复有哪些注意事项？
1、pH的应用范围及选择抗原修复液的pH非常重要，有效的抗原修复pH要比修复液的化学成分更重要，同样的修复液随着pH的升高染色的强度逐渐增强，但最佳pH范围为6.0-10.0。目前大家公认的最好的抗原修复液是pH6.0的柠檬酸盐缓冲液和pH8.0的EDTA缓冲液。作为通用修复液碱性pH的修复液要比酸性的有效，而对固定很长时间旧的存档组织，酸性pH的修复液则优于碱性的修复液。
2、抗原修复时应选择最佳温度70-90℃的温度对未经固定的蛋白质可发生变性，但经福尔马林固定的蛋白质，温度必须达到92℃以上方能使其变性。研究结果显示，温度为92-98℃是合适的，95℃效果最好。
3、抗原修复液必须遵循自然降温规律，否则效果不好或达不到抗原修复的目的抗原修复持续时间过后，取出放于室温中让其慢慢地降温，绝对不能为了争取时间，强行用冰块或冷水使其降温。这是因为当高温中的抗原蛋白分子链脱离了其他的束缚或联结，要有一个自然环境让其自然放松下来，随着温度的降低，它们会慢慢地恢复原来的形态和构型。
4、尽量使用足量的抗原修复液应用于抗原修复的液体，一定要充足，防止切片干涸。应用大量的抗原修复液时，由于它的量较大，可延缓液体的沸腾时间，增加切片受微波辐射的量，对抗原修复将达到彻底。更多免疫组合步骤流程参考干货：免疫组化流程及常见问题分析声明：部分图源网络，侵权联删
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检验医师

抗原修复是甲醛固定—石蜡制片的标本进行免疫组织化学检测的一种增进检测灵敏度的方法。通过加热或酶消化的方法，可使标本中待检分子的抗原决定簇恢复固定前的空间结构特点。除了石蜡切片，经甲醛固定的冷冻切片，如果检测灵敏度不足，有时也可进行抗原修复。是否进行抗原修复，关键在于判断检测不出阳性结果的原因是否由化学固定的变构效应引起，而不是看是否采用石蜡制片法。抗原修复操作后，特异性抗原—抗体反应的强度提高，有利于目标分子的正常检出。
目前常用的抗原修复技术有热修复和酶消化修复两类。通常热修复最为有效，结构损伤和其他副作用很少，操作也更为简便。
㈠热修复法
热修复的基本原理是：使蛋白质处于水相环境中，加热使蛋白水解过程加速，从而打开因固定交联而形成的化学连接，暴露原先被遮蔽的抗原决定簇。
热修复法的关键因素有两个：一是要加热到足够温度并持续一定时间，二是采用pH值适宜的修复缓冲液。温度条件一般应达到使水沸腾的温度。微波炉800W（高火）以上快速加热，通常2 ~ 10 min就能达到满意效果，因此是最方便快捷的加热方式。高压锅和蒸锅煮沸的方式也可，但时间条件需要预试。修复液的pH值多少算合适，与待检抗原的特点有关。绝大部分抗原在pH 8.0 ~ 9.0时很容易被加热修复。但碱性环境下某些切片的脱片率升高，会造成损失或使切片与玻片的贴附松动，给后续检测带来麻烦。pH 6.0的条件则比较保险，切片不易脱落，且大部分抗原在该酸度条件下加热，抗原性也均能恢复，尤其对核抗原的修复效果更佳。故pH 6.0的枸橼酸缓冲液或pH 8.0的EDTA缓冲液是最常用的抗原修复液。前者常作首选；对于较难检出的抗原，特别是某些膜蛋白受体，则换用后者。
枸橼酸修复液不能过于偏酸，以防增加背景的非特异性着色，并可能对苏木素的复染效果造成一定干扰。EDTA修复液应检查并调整pH为8.0；修复操作的方法与枸橼酸修复液相同。



抗原修复温度和修复液pH值的一般关系

㈡酶消化修复法
酶消化较之加热修复，操作条件更难控制，组织结构损伤的几率更高，目前已非主要方法。但是，有少数待检分子用酶消化的效果可能比热修复略好，这时就要做出选择。对需要采用酶消化修复的实验，须根据消化强度要求选择合适的酶。比如轻微消化可选用无花果蛋白酶，中度的细胞内抗原消化可选用胰蛋白酶，强消化可选用胃蛋白酶，结缔组织和细胞外基质的消化可选用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶，等等。注意上述方案并非铁律，应根据预试结果和操作经验决定。常用酶修复液的配方和工作参数简述如下。
胰蛋白酶修复液：胰蛋白酶0.05 g，无水氯化钙0.05 g，溶解后用NaOH溶液调整pH到7.6，定容到100 ml。须临用前配制。消化条件为37 ℃ 10 ~ 30 min；深固定的组织如果效果不够且显微结构未见明显损伤，可适当加长时间。
无花果蛋白酶修复液：无花果蛋白酶0.05 ~ 0.1 g，pH 7.4 PBS溶解并定容到100 ml。消化条件为37 ℃ 30 ~ 60 min。
胃蛋白酶修复液：胃蛋白酶0.4 g，溶解于0.01 mol/L HCl 100 ml。也可用0.1%枸橼酸溶解。消化条件为37 ℃ 30 min ~ 2.5 h。

卡卡

在样本制备的过程中，往往会应用一些试剂（如多聚甲醛、福尔马林等）对新鲜组织进行处理，这个过程可能导致抗原位点被封闭，为了避免影响后续免疫染色的效果，我们需要先对切片进行抗原修复。对于石蜡切片来说，抗原修复是不可或缺的步骤，常用的方法有酶消化法和热修复法。
1、酶消化法
作为最早的抗原修复方法，常用的消化酶有三：胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K。但酶的作用极易受温度影响，如果消化不足，则无法充分暴露出抗原位点，过度的消化又会破坏组织结构，影响最后阳性信号的判读，因此在后续的发展中，酶消化法渐渐被热修复技术所替代，但对于个别抗原，如免疫球蛋白、补体，以及在甲醛固定、石蜡包埋的肾活检中，酶消化法依旧不可替代。
2、热修复法
抗原热修复是采用高温、高压方法配合合适的抗原修复液，使得被固定液封闭的抗原位点重新暴露，提高抗体的阳性检出率。

最常用的抗原修复液有两种：柠檬酸钠缓冲液（pH=6）、EDTA缓冲液（pH=8或9），一般来说一抗的说明书都会写明需要选择哪种修复液。如果说明书没有推荐，柠檬酸钠缓冲液能够适配大部分的抗体，EDTA缓冲液相对修复效果更强，但阳性增强的同时也会提高非特异背景，一些比较难表达的抗体可以选择EDTA缓冲液。


常见热修复方法对比


小爱温馨提示，没有哪一种抗原修复液或者修复方法能够适配所有的抗体和样本，最佳条件还是需要在摸索实践中确定哦！
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同花顺

是不是注射了