请问这个western blot是什么问题？

千姿百态

在30kDa以下的条带中，偶尔会出现折中形状很奇怪的。自己分析不出哪里出了问题，麻烦各位老师、同学帮忙分析，指导如何解决。
转膜问题？还是膜自身没有浸泡充分？请指教！！！谢谢！！

原文地址：https://www.zhihu.com/question/472738495

清风寡欲

转膜有气泡，样品方面第一张膜前后属于同时期的样品吗

长长的路

第二个图应该是转膜点时候有气泡叭，蛋白样品过不去，被泡冲散了。也有可能是胶里有胶粒，蛋白样品跑不下去

检验医师

请问题主这个问题解决了吗？WB小白也遇到了一样的问题

检验医师

生物实验，尤其是步骤比较多、耗时比较长的生化实验，一定要做质控。WB步骤中，有几个点是可以做质控的。不然，等到最后显影之后才发现问题，为时已晚。

• 蛋白定量：这是一个容易被忽视的点。我们实验室有一句话，叫做“shit in, shit out”。蛋白样品制备后，如果定量不准确，肯定会影响WB结果。如果蛋白定量过程中发现样品浓度相差极大，也可能预示着蛋白样品的质量有问题。
  
• 胶的质量：跑完胶之后，可以用SYPRO Tangerine Protein Gel Stain染一下胶。这种染色不固定蛋白，不会影响后续转膜。这里会碰到的问题主要就是通常的跑胶问题，诸如拖尾、笑脸、粗带等等，都可以通过改进制样方法（煮蛋白加DTT、离心样品等）、选择合适的胶（降低胶浓度、增大浓缩胶长度等）或跑胶条件（低电压、低温跑胶等）解决。
  
• 膜的质量：转完膜之后，可以用Ponceau S染一下膜。这种染色可以完全被blocking buffer洗脱，不会影响后续的probing。这里主要是看有没有转膜不均匀、有气泡等问题。改进方法包括选择不同的膜（PVDF或Nitrocellulose）、改进transfer buffer（有的样品需要在transfer buffer里加SDS）以及低电压过夜转膜等等方法。
  
• 抗体probing：这里其实比较routine，不太会出错（要错也是选错了抗体）。如果前面几步都没有问题，但是最后显影的时候比较“脏”，可能是blocking buffer不行。可能是牛奶没混匀，也可能需要换含BSA的blocking buffer。
  

你的WB问题可能是多方面的。首先，转膜肯定是不均匀且有气泡的，尤其是第二张图。你需要充分浸润胶、膜、滤纸，并保证它们之间没有气泡。其次，几乎所有的条带都是“哑铃状”的，这说明跑胶温度过高。而且，如果这两张图都是30kD以下的图，那么条带如此扭曲，说明你的上样样品里可能有蛋白交联形成的颗粒。另外，如果你不是在probe蛋白标签的话，你的这个抗体给出太多条带了。你需要考虑换一个一抗。
以上。

同花顺

1，转膜有气泡
2，封闭液如果是脱脂奶粉的话每次尽量用新配的，最好提前1h配出来摇匀。