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风云

目前液体活检在国内的应用情况如何？
肿瘤的液体活检主要包括循环肿瘤DNA（即circulating tumor DNA，ctDNA）、游离肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）及外泌体（exosome）。众多研究表明三者与肿瘤的早诊、治疗、预后等均存在相关性。目前在临床应用最多的当属ctDNA检测。
正常人的体液内亦存在来自于机体正常细胞的游离DNA，简称循环游离DNA；在肿瘤患者体内，循环游离DNA不仅仅来自于正常细胞，还有一部分来自于肿瘤细胞，即ctDNA是循环游离DNA的一部分，因此我们可以通过检测ctDNA相关变异状态作为来自肿瘤细胞的标志物。目前临床肿瘤ctDNA检测最常见的应用领域为治疗方案选择及耐药监测。
由于ctDNA具有片段化程度高、丰度低等特点，其主流检测方法包括Cobas法、Super-ARMS法、高通量二代测序（NGS）及数字PCR。
Cobas检测：作为第一个被美国食品药品监督管理局（FDA）批准的ctDNA检测试剂盒，仅对血液ctDNA中的EGFR基因常见突变进行检测，在以上四种ctDNA常用检测方法中敏感度较低；
Super-ARMS法：仅对EGFR基因常见突变进行检测，其通过对传统扩增阻遏突变系统（Amplification Refractory Mutation System，ARMS）法的优化升级，灵敏度更高，可检测低至0.2%丰度的突变，并且于2018年通过中国药监局审批；
NGS：优点在于可同时检测多个基因相关变异，能在最短的时间内对患者肿瘤变异情况做出全面了解，缺点在于操作复杂，费用较为昂贵；
数字PCR检测：为目前最敏感的检测方法，可以识别低至0.03%的突变，但是缺点在于检测通量低，每次仅能检测一个位点，并且仅能检测已知位点的突变。
哪些情况下适合采用液体活检？
要了解液体活检具体的应用场景，首先应明确液体活检的优劣势。
液体活检最大的优势在于微创、快捷，易于动态监测；一定程度上全面反映肿瘤整体变异状态，不受肿瘤异质性影响；适用人群更广泛，对于难以取得活检肿瘤组织或取得肿瘤组织不够基因检测的患者，液体活检提供了一个了解肿瘤基因变异状态的有效途径。
然而，液体活检最大的劣势在于其并非富集肿瘤的检材，大量的正常组织释放基因组DNA稀释了肿瘤来源的DNA，造成ctDNA突变丰度很低（一般低于1%），对ctDNA突变的检测无异于大海捞针，或者更形象地说：从一堆稻草（正常组织来源的循环游离DNA）中找一根针（来自肿瘤细胞的ctDNA）一样困难，因此对ctDNA的检测方法灵敏度提出了更高的要求。
1. 早期诊断
肿瘤的早期诊断其最大特点为肿瘤负荷很低，可能影像学上都没有明确的肿瘤病灶。此时血液中ctDNA的含量亦极低，普通针对ctDNA突变的检测难以满足早诊的要求。
值得庆幸的是，细胞从癌前状态向癌症发展过程中，DNA甲基化改变是贯穿整个恶性转化的表观遗传学改变。即使在肿瘤发展的最早期阶段，DNA甲基化模式也已经与正常细胞存在显著差异；其次，甲基化水平的改变是具有组织特异性的，即对甲基化进行检测及比对，能够进行器官溯源，发现到底是哪里可能会发生或已经发生了肿瘤。
因此，对ctDNA的甲基化水平进行检测，是一种有效的肿瘤早期筛查辅助手段。比如SEPT9基因甲基化检测试剂盒对结直肠癌诊断的敏感度及特异性可达74.8%及97.5%[1]，现在已经可以作为一种结肠镜前的初筛手段。
2. 指导靶向治疗

肿瘤的靶向治疗是目前临床最常见的ctDNA检测应用场景。根据《非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识》[2]，如果有肿瘤组织，推荐直接用肿瘤组织进行驱动基因检测；但是若没有肿瘤组织样本或者肿瘤组织样本不足的情况下，液体活检可作为很多患者基因检测的首选。
由于中国非小细胞肺癌人群中EGFR为最常见的驱动基因变异（约40%-55%），此时对肿瘤驱动基因的检测，既可以使用Cobas或者Super-AMRS法对EGFR基因常见突变进行检测，也可以使用NGS，一次性对所有肺癌相关驱动基因变异进行全面检测。
但无论是何种检测方式，应注意的是若组织活检或者液体活检有任何一个是阳性，患者就应当考虑使用靶向药物；当液体活检先行的时候，若液体活检为阴性，应提示患者可能存在假阴性，必要时再取活检，以避免错失可能的靶向治疗机会。
3. 耐药监测

靶向治疗终归面临耐药的问题，而液体活检由于微创快捷的优势，是理想的耐药监测材料。对于EGFR一代或者二代TKI用药人群，约半数以上的患者出现EGFR 20号外显子T790M而耐药[3]，因此对于此类患者的耐药监测可使用敏感度高且成本低的数字PCR法对T790M单点进行监测。如果患者已经出现了耐药，亟需探索其耐药机制以更换治疗方案，此时推荐使用NGS对基因变异的整体状态进行检测，以便全面寻找耐药原因。
4. 预后评估

在预后评估方面，微小残留病变（MRD）是目前研究的热点。MRD指的是治疗后传统影像学和实验室方法无法发现，但通过分子诊断可以发现的肿瘤来源的分子异常。多种肿瘤的相关研究表明，ctDNA突变状态可提示接受根治性治疗的患者的预后复发，并且已经在部分临床实验中得到应用。
但是正如2021年发表于循证医学的《引领肺癌治疗新时代的标记物——微小残留病灶》述评[4]中指出的，MRD检测还面临诸多问题，比如用何种方法来进行ctDNA MRD检测，如何兼顾灵敏度和成本效益，用何种标准来进行判读等。如今大部分肺癌相关临床试验突出的是MRD的阳性预测价值，而将MRD作为治疗预测标记物的研究并不多。
//  要点提示 //
由于液体活检具有微创、方便、易于重复等特点，因此在疗效监测、MRD评估及耐药机制上有着组织活检所不可比拟的优势。在临床上，当患者无法获取肿瘤组织或者肿瘤组织不够基因检测的时候，液体活检为了解患者基因变异状态打开了一扇窗户。
但是，无论是何种高灵敏度液体活检检测手段，都有假阴性的问题。因此我们应时刻提示自己，对于液体活检检测阴性的患者，应当结合其组织活检状态、临床表现等综合分析。此外，我们也应当根据临床应用场景，选择合适的液体活检检测方法，在满足患者需求的同时，达到快速、准确的检测目的。
血液样本送检有哪些注意事项？
血液的规范化处理是保证液体活检结果准确的基本前提。在血液样本的送检方面应注意以下几点：
1. 采血管的选择
用于ctDNA检测的血液需使用EDTA抗凝管或者cfDNA专用采血管。若使用EDTA抗凝管，血液离体后应尽量保存于4℃，2小时内需尽快进行血浆分离；若使用cfDNA专用采血管，血液可在常温保存3-5天。切记严禁使用肝素抗凝管，因为肝素在后续DNA提取过程中难以去除，并且会抑制PCR反应，导致后续ctDNA检测失败。
2. 采血量及采血注意事项
一般而言，ctDNA检测需要采集8-10ml的全血[2]。采血后严禁剧烈震荡血液，或者使用注射器针头对血液进行转移，因为这样的操作均会导致血液中细胞破裂，从而造成基因组DNA的污染，增加ctDNA检测的假阴性；此外溶血造成血红蛋白及其代谢产物的大量释放，从而抑制PCR扩增效率。采血后应轻柔将采血管颠倒8-10次进行混匀。
3. 患者采血时间的选择
一般建议患者空腹进行抽血，特别是血脂较高的患者。这是由于低密度脂蛋白对荧光有屏蔽和吸收的作用，会干扰后续ctDNA的相关检测；三酰甘油会降低ctDNA的提取率；若使用微滴式数字PCR检测技术，血液中的脂质会影响后续微滴的生成。此外，对于正在进行化疗的患者，一般建议患者化疗结束后进行抽血。
罕见靶点检测如何选择合适的检测方法？有哪些注意事项？
肺癌的罕见靶点主要指的是发生率低于5%的驱动基因变异。虽然发生率低，但是结合我国肺癌人群的庞大基数，此部分患者数量依然众多。由于这部分驱动基因变异的发生率较低，结合卫生经济学、肿瘤组织量的限制及检测流转时间（turn around time）的要求，推荐使用NGS技术来进行罕见靶点的检测。
应注意的是，选择NGS对罕见靶点进行检测时，应注意选择panel的大小及是否覆盖所需要检测的靶点；ALK、ROS1、RET等基因的融合，应注意panel对融合基因的内含子的覆盖度（因为融合断裂点大多数位于内含子，内含子覆盖度低可能造成融合检测的假阴性）；对于基于DNA NGS测出的罕见融合，或者DNA NGS检测驱动基因全阴性但临床高度怀疑存在驱动基因变异的人群，建议有条件的话使用RNA NGS进行进一步验证[5]。

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