免疫荧光（IF Staining)

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切片脱蜡

• 切片摊片：42℃烤片3h，过夜干燥；
  

2. 脱蜡处理：60℃ 2h烤片，二甲苯I 10min脱水；二甲苯II 10min 脱水；100% 乙醇1 3min，100% 乙醇2 3min，100% 乙醇3 3min，96% 乙醇1 3min，96% 乙醇2 3min，85% 乙醇1 3min，70% 乙醇1 3min，纯水20s；
3. 解交联：37℃ 3min烤片（开盖），pH 9.0 TE buffer （150ul/well），吸弃；pH 9.0 TE buffer （100ul/well），70℃ 60min;
4. 清洗试剂：1*PBS （100ul/well)，室温孵育5min，吸弃；

免疫荧光染色（一抗染色）

• 阻断剂准备（冰上操作）：准备2x blocking buffer，吹打混匀10次后再瞬离；
  

2. 抗体准备（冰上操作）：根据下表准备抗体，吹打混匀10次后再瞬离；


3. 阻断剂准备（冰上操作）：准备1x blocking buffer，吹打混匀10次后再瞬离；


4. 一抗孵育：加入 1x Blocking Buffer（100ul/well），室温孵育5min，吸弃 Blocking Buffer，加入抗体（100ul/well），室温孵育60min，吸弃抗体；
Note：注意试剂要将切片全部均匀覆盖。
5. 漂洗：加入 1x Blocking Buffer（100ul/well），室温孵育1min，吸弃 Blocking Buffer，重复三次，总共用阻断剂清洗4次；
6. 将切片放在50mL离心管内，1*PBS 漂洗20s，取出切片，不要让切片干燥；

免疫荧光染色（一抗二抗）

• 阻断剂准备（冰上操作）：准备2x blocking buffer，吹打混匀10次后再瞬离；
  

2. 阻断剂准备（冰上操作）：准备1x blocking buffer，吹打混匀10次后再瞬离；


3. 抗体准备（冰上操作）：按照下表配制mix，吹打混匀10次后再瞬离；


4. 准备1X Washing buffer：吹打混匀10次后再瞬离；


5. 二抗准备（冰上操作）：按照下表配制mix，吹打混匀10次后再瞬离；


6. 加入 1x Blocking Buffer（100ul/well），室温孵育5min，吸弃 Blocking Buffer；
7. 加入一抗（100ul/well），室温孵育60min，吸弃抗体；
8. 加入1x Washing Buffer（100ul/well），室温孵育5min，吸弃Washing Buffer；重复洗切片2次，总共清洗3次；
9. 加入二抗（100ul/well），室温孵育60 min，吸弃抗体；
10. 加入1x Washing Buffer（100ul/well），室温孵育5min，吸弃Washing Buffer；重复洗切片2次，总共清洗3次；
11. 将切片放在50mL离心管内用1XPBS 浸泡20s，然后将切片取出，不要让切片干燥；
12. 加入5滴抗淬灭封片剂均匀的铺在载玻片上，然后完成盖片，立即完成成像（避免干燥和荧光物质淬灭）.

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