Western Blot 常见问题及解决方案

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Western Blot分为四个基本的步骤：样品制备—电泳—印迹—免疫检测
对Western Blot常见问题进行归类，总结出了以下几类：
首先来看Western Blot遇到的第一个问题——样品制备。
一、样品的常见问题
1. 如果目标蛋白是膜蛋白或胞浆蛋白，操作需注意什么？
解答：如果目标蛋白是膜蛋白或胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多。目前市面上有专门针对亚细胞组分的蛋白抽提试剂盒，可以高效的富集到活性蛋白。
2. 处理组织样品有什么注意事项？
解答：组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性。
二、电泳转移的常见问题
1. 大分子量蛋白的转移效率低？
解答：（1）优化转移缓冲液；（2）转移缓冲液中加入20%甲醇，甲醇可以降低蛋白的洗脱效率，增加蛋白和膜的结合能力。（3）转移缓冲液中加入终浓度0.1% SDS。（4）提高转移电压/电流，增加转移时间。（4）选择优质的转移膜。
2. 膜、滤纸、胶大小有何讲究？
解答：滤纸的长宽分别比胶小1—2mm，而膜的长宽分别比胶大1—2mm。绝对禁忌：上下两层滤纸因为过大而相互接触，这样会导致短路。
三、检测结果中常见的问题
1. 背景过高？
解答：背景过高可能是由很多因素引起的：封闭不完全、显色过度、洗涤不充分、转移缓冲液或设备有污染、抗体稀释度不对或抗体不纯。
（1） 封闭不完全
一抗或二抗只要结合到膜上，就会显色。为了避免非特异性的结合，应用封闭液孵育膜，使所有的空白位点都被封闭蛋白占有。NC膜推荐封闭液是3%的明胶，室温孵育1小时。如果想要低温封闭的话，可以用3%的BSA。PVDF膜推荐的封闭液是5%的脱脂奶粉。
传统的牛奶/蛋白类封闭剂会形成较厚的、粘粘的蛋白层，导致与抗体发生非特异性相互作用，增加背景；另一方面，牛奶中本身含有的磷酸化蛋白会干扰蛋白磷酸化检测。
（2） 显色过度
显色时间的长短取决于蛋白条带的数目以及你想要的灵敏度。如果膜在显色液中放置太久，背景就会偏高。应当在蛋白条带清晰可见，而背景几乎没有或很少时，将膜及时取出。
（3） 洗涤不充分
在封闭以及抗体孵育之后，至少要洗两次膜，每次5分钟。去污剂的浓度不要太高，否则会把抗原从膜上洗下来。
（4） 转移缓冲液或设备污染
使用清洁剂将转印槽内外彻底清洗干净，海绵垫也一定要认真清洗，脏的海绵垫通常是污染的最主要原因。另外，每次转膜时的缓冲液都要是新鲜配制的。
（5） 抗体稀释度不正确
一抗的稀释度应根据抗体来源和经验来决定。一般来说，以1:100-1:1000来稀释血清或组织培养上清，以1:1000-1:10000来稀释腹水或超免疫动物的血清。抗体稀释度不够，会产生非特异的结合，带来高背景。
（6） 二抗不纯
没有交叉吸附过的二抗可能会与膜上的其他蛋白相互作用，产生杂带。这种情况可以选用单克隆的二抗。
2. 信号较弱？
解答：杂交信号弱也是由多方面因素造成的：
（1） 封闭剂不合适
封闭剂可能与目的蛋白有亲和性而干扰了检测。换用其他封闭剂或减少封闭剂的用量及孵育时间。
（2） 抗体失活或抗体浓度太低
抗体长期保存应在—70℃，使用前最好做效价检测；增加抗体浓度。
（3） 抗原不充足
抗原不充足也就是目的蛋白的量不够，应该适当增加蛋白的上样量，并且做已知标准量蛋白的对照。
（4） 膜漂洗过度
减少漂洗的时间和次数。
（5） 蛋白转移有问题
蛋白转移不充分，导致膜上的蛋白量很低，减弱了检测效果。应该优化蛋白转移操作过程，选用高品质的转印膜。
3. 出现非特异性条带？
（1） 一抗的特异性低/一抗浓度过高
重新选择一抗，尽量使用高品质的单克隆一抗。增加一抗的稀释度。
（2） 二抗浓度过高/二抗出现非特异结合
增加二抗的稀释度；选择特异性强的二抗。
（3） 抗原量过高——减少蛋白上样量。
原文：Western Blot 常见问题及解决方案

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