为什么免疫组化可以进行图像分析而免疫荧光不可以？

莺歌燕舞

免疫组化DAB染色法是在明场，即光镜下进行观察，全程不涉及荧光激发过程。DAB染色后的切片基本不会褪色。也就是说 DAB染色后的切片观察不会受到时间、地点、观察者变化等影响，其阳性表达的强度和范围在封片之后是不变的。这是DAB法染色后能够进行定量分析的根本原因。
而蛋白免疫荧光不适合定量分析。因为免疫荧光染色的关键是荧光二抗，之后在荧光场下进行拍照，留取照片。 表面上看，这个过程与DAB染色后类似，但实际上其中存在相当多的变量，正是这些变量导致免疫荧光染色不适合做半定量分析。涉及的变量有下面这些：
一、荧光二抗的质量好坏决定了荧光染色效果：
同样一张切片、细胞爬片， 采用国产荧光二抗和进口荧光二抗，效果上存在非常大的差异，因此，我们不能仅就荧光强度和分布范围来推断蛋白表达水平不同。
二、荧光拍摄条件：
拍摄环境、显微镜品牌和激发荧光决定了镜下观察的效果。同样的操作方法和切片，在不同品牌显微镜下显示出不同的荧光强度。但事实上，切片上的蛋白从未变化，改变的是拍摄条件。
三、荧光衰减：
荧光衰减是非常明显的。同样的一组切片，1小时内拍摄和8小时后拍摄，荧光效果显然不同。再举个例子，50张荧光染色切片，分析第1张和分析到第50张时，荧光强度已经发生了变化。尽管现在有商用的防荧光衰减试剂，但这些试剂仅能荧光染色在自然环境下不会快速衰减。荧光染色后在激发光的直接作用下，10秒左右就会快速衰减。
但是，TUNEL荧光染色可以进行图像分析。因为TUNEL荧光染色分析的本质是一个计数问题，即通过计数凋亡细胞核的数量，来分析该张组织切片或细胞爬片上的凋亡指数。这个过程，我们的计数不会受到荧光衰减的强烈影响。只要判断出荧光信号确实属于凋亡细胞核，不管其信号点的大小如何，只要存在信号，我们就可以计数为1个凋亡核。
既然免疫荧光不适合做半定量分析，那么它到底有什么作用呢？免疫荧光本质上最适合作为定位分析指标。我们可以通过不同的荧光二抗，在不同的激发光下，在同一张切片上的merge出不同染色效果。借此，我们可以对研究的蛋白分布范围、空间相互关系进行评价。这对于研究细胞内超微结构或者是蛋白受体等十分重要。常规的DAB染色根本无法满足要求。

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