ELISA法有哪几种类型，其原理各是什么？

青草

ELISA法有哪几种类型，其原理各是什么？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/500205345

队长是我

原理
Elisa本质上是利用了抗原和抗体的特异性结合反应将待测物和酶连接，通过酶与底物产生颜色反应来定量检测样品中目的蛋白浓度。

常见类型
直接法：将抗原固定在板上，用酶标抗体直接检测抗原。
间接法：将抗原固定在板上，先加入检测抗体和抗原特异性结合，然后加入酶标二抗和底物显色。
夹心法：将捕获抗体固定在板上，与抗原结合后加入捕获抗体，之后和直接法或间接法类似，区别在于捕获抗体是否酶标记。
竞争法：将抗体固定在板上，一组加入样品和酶标抗原混合液，另一组加入酶标抗原，样品中的待测抗原越多，能竞争掉越多的酶标抗原，输出信号越弱。故输出信号和样品中待测抗原浓度成反比。

优缺点
直接法：
操作简单，不使用二抗避免交叉反应
标记一抗成本高，不使用二抗无信号放大

间接法：
成本低，二抗放大信号
使用二抗，交叉反应几率增加

夹心法：
特异性强，灵敏度高
抗原必须有至少两个表位

竞争法：
可适用于低纯度样本
敏感度较差

*以上内容来自网络

卡卡

【ELISA 夹心法视频】Biorbyt 科研小助手给大家讲讲ELISA夹心法，内含详细的实验原理动画解析，不可错过，值得收藏！

感恩由您

目前常用的ELISA方法有直接法、间接法、双抗夹心法、竞争法ELISA。


#01直接法
将抗原固定于ELISA班上，然后用酶标抗体直检测抗原。
相较于其他类型的ELISA实验，直接ELISA实验步骤少，检测速度快，不需要用到二抗，避免了交叉反应，检测结果不容易出错，
但是由于直接ELISA的抗原不是特异性固定的，样本中的靶蛋白及其他杂质蛋白都会与ELISA版结合，实验背景会比较高，而且直接ELISA每种靶蛋白都需要准备能够与其特异性结合的一抗，实验不太灵活。另外由于没有使用二抗，信号没有被放大，降低了测定的灵敏度。
#02 间接法
将抗原固定于ELISA班上，随后分两步进行检测：首先加入检测抗体于抗原特异性结合，随后加入酶标二抗检测并利用底物显色。
于直接ELISA相比，间接ELISA用到酶标二抗，具有更高的灵敏度，也需要更少的标记抗体，更经济，间接ELISA还提供了更大的灵活性，
缺点：存在交叉反应的可能性（酶标二抗直接与抗原结合），可能会增加背景，同时与直接ELISA相比，间接ELISA实验多了二抗孵育的步骤，实验周期延长。

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03# 夹心法
被检测的抗原包被再两个抗体之间其中一个抗体将抗原固定于载体上，即捕捉抗体，另一个则是检测抗体，此抗体可用酶标记后直接测定抗原的量，或不标记，再透过酶标记的二级抗体来测定抗原的量，这两种抗体必须小心选取，才可以避免交互反应货竞争相同额抗原结合部位。
04# 竞争法
预先将抗原包被再固相载体上，并加入酶标记的特异性抗体，实验是，加入待检抗原（或抗体），如果待检物是抗原，则待检抗原于预先包被再固相载体上的抗原竞争结合酶标抗体，如果待检测物是抗体，则待检抗体就与系统中原有的酶标抗体竞争结合包被再固相载体上的抗原，通过洗涤洗掉被竞争结合的酶标抗体，最后加底物显色，需要注意的是显色结果与待检抗原（或抗体）的量成反比
竞争ELISA相对以上的三种方法更复杂一些，但以上三种ELISA类型都适用于竞争ELISA的形式，其主要有点在于可检测不纯的样品，且数据再现性高，但存在整体敏感性和专一性较差的问题。
在测定蛋白质等大分子时常用双抗夹心ELISA方法，在敏感性基因特异性上有明显的优势。

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队长是我

常用方法及原理如下：
1. 夹心法：
夹心法常用于检测大分子抗原，一般的操作步骤为:
a. 将具有专一性的抗体固著（coating）于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体
b. 加入待测检体，检体中若含有待测的抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结
c. 洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一的一次抗体，与待测抗原进行键结
d. 洗去多余未键结一次抗体，加入带有酶的二次抗体，与一次抗体键结
e. 洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色结果
原理：针对抗原分子上2个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物。

2. 间接法
间接法常用于检测抗体，一般的操作步骤为：
a. 将已知的抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余的抗原。
b. 加入待测检体，检体中若含有待测的一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结。
c. 洗去多余待测检体，加入带有酶的二次抗体，与待测的一次抗体键结。
d. 洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酶呈色，藉仪器（ELISA reader）测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。
原理：利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体。

3. 竞争法
竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为：
a. 将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体
b. 加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结
c. 加入带有酶的抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酶的抗原可键结的固著抗体就越少，亦即，两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结，即所谓竞争法之由来。
d. 洗去检体与带有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，当检体中抗原量越多，代表塑胶孔盘内留下之带有酶的抗原越少，显色也就越浅。
e. 当需要侦测无法获得两种以上单一性抗体的抗原，或是不易得到足够的纯化抗体以固著于孔盘上时，一般会考虑使用竞争法ELISA。
原理：将特异性抗体包被于固相载体表面，经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液，另一组只加酶标记抗原，经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知抗原的量。