文献分享 ｜Nature Biomedical Engineering发表“抗体表面展示的细胞外囊泡用于靶向癌症治疗”

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今天为大家分享一篇2024年发表在Nature Biomedical Engineering的文章，题目为“Antibody-displaying extracellular vesicles for targeted cancer therapy”。本文中，作者开发了一种模块化的细胞外囊泡（EVs）系统（Fc-EVs），能够通过特定的Fc结合域与不同类型的IgG抗体结合，从而实现对几乎任何组织的靶向，并在构建药物递送系统用于肿瘤的精准治疗中具有巨大潜力。

01背景介绍

程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）及其配体PD-L1是免疫疗法中的主要靶点之一，尽管PD-L1在多种恶性肿瘤中高度表达，但只有部分患者对治疗有持久反应。为了提高反应率，治疗策略包括联合化疗、多重检查点抑制和其他免疫刺激方法。然而，这些策略在将不同治疗方法协调递送到目标部位时存在局限性。EVs是一种直径范围从30 nm到2000 nm且具有异质性的天然纳米囊泡。EVs含有来自亲本细胞的脂质、蛋白质和核酸，并且具有通过细胞间通信系统传递这些大分子的独特能力，可以影响邻近细胞或远处细胞。因此，利用EVs构建靶向癌症治疗的模块化递送系统具有广阔前景。

02设计思路

该研究利用分子工程工具，开发了能够结合抗体片段可结晶区（Fc）的EVs，使得可变区能够展示以识别抗原。这种Fc结合的EVs（Fc-EVs）可以修饰不同类型的抗体，从而靶向几乎任何感兴趣的组织。

图1 原理图
03数据介绍（1）Fc-EVs的优化
为了优化Fc-EVs的展示效率和靶向能力，作者筛选了不同的Fc结合域和EVs分选域。作者首先对9个在C端或N端与报告蛋白mNG融合的EV分选结构域进行评估（图2a）,通过成像流式细胞术（IFC）结果可以发现当mNG与四次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81)、膜联蛋白V或肿瘤坏死因子受体(TNFR)融合时，细胞表现出最高的表达水平(图2b)，而其他EVs分选域的mNG水平较低。接着，通过比较表达9种不同EV分选结构域的不同EV生成细胞的条件培养基，TNFR和四跨蛋白，特别是C端融合的CD63，每毫升mNG阳性(mNG+)数胜过其他EVs分选结构域 (图2c) 。通过与四次跨膜蛋白或TNFR融合，EVs被设计成显示蛋白A、z或4z结构域。所有构建体都产生了带有Fc结合物的工程化EVs，CD63-z的结合产生了最高水平的表达(图2d)。所有EV都显示出抗体结合能力，当使用z结构域时，四次跨膜蛋白构建体之间的结合效率相似，但使用TNFR作为表达支架时，其结合效率明显较低(图2d)。当使用4z或蛋白A作为Fc结合剂时，也观察到类似的趋势。此外，CD63-z融合也产生了最高表达水平的工程化EVs(图2e)，因此，作者最终确定了CD63与z域融合产生的EVs作为最佳的Fc-EVs候选者，展现出最高的表达水平和Fc结合能力。

图2 EV分选蛋白和Fc结合域的筛选

（2）Fc-EV的表征

作者使用多种方法详细表征了Fc-EVs的物理特性和功能性。首先，作者采用纳米颗粒跟踪分析（NTA）技术进行分析，结果表明Fc-EVs具有大约100 nm的峰径（图3a）。为了进一步确认抗体与Fc-EVs的结合，作者用尺寸排阻色谱（SEC）（图3b，e）、IFC（图3c）、纳米成像（图3f）证明了Fc-EVs与抗体的有效结合。接着，作者同时评估了不同IgG亚型对Fc-EVs的亲和力（图3d），其中人IgG1（hIgG1）对 Fc-EVs的亲和力最大，这与之前关于蛋白质 A 和 z 结构域的报道结果一致。最后，作者使用单颗粒分析仪（SPP）对单个EV上抗体的定量分析（图3g、h、i）。综上，证实了抗体能够高效且稳定地结合在Fc-EVs上。

图3 Fc-EVs的表征

（3）抗体修饰的Fc-EVs的多功能靶向性

为了证明所开发的Fc-EVs技术能够实现对肿瘤细胞的高效靶向，作者使用特定的肿瘤细胞系：HER2阳性的乳腺癌细胞和PD-L1阳性的黑色素瘤细胞，在体外验证修饰相应抗体后Fc-EVs的靶向能力。与未修饰的EV相比，在临床使用的 HER2 抗体曲妥珠单抗的引导下Fc-EVs能被HER2 阳性乳腺癌细胞（SKBR-3 细胞）显著摄取（图4a）。在PD-L1表达的恶性黑色素瘤细胞（B16F10）系中也得到了相似的结论，在阿替利珠单抗的引导下，Fc-EVs 能被B16F10细胞显著摄取（图4b）。荧光显微镜成像结果（图4c）进一步证实了抗体修饰后能够显著提高肿瘤细胞对EVs的摄取。

图4 使用抗体进行Fc-EV靶向

（4）抗体修饰的Fc-EVs靶向肿瘤

作者通过PD-L1抗体修饰的Fc-EVs在恶性黑色素瘤（B16F10）荷瘤小鼠模型中的表现反映抗体修饰后Fc-EVs的肿瘤靶向能力（图5a）。与单独使用 Fc-EVs相比，PD-L1-Ab的修饰显著增加了 Fc-EVs 在肿瘤组织中的积累，而同种对照不影响Fc-EVs在肿瘤中的积累（图5b），用Fc-EVs+ PD-L1-Ab处理的小鼠，在注射后30分钟肿瘤积累达到最高水平（图5c）。作者也评估了Fc-EVs在血浆中的半衰期，与先前的调查结果一致，Fc-EVs在血浆中的半衰期为3-4分钟，与单独使用Fc-EVs或显示PD-L1-Ab或IgG-ctrl时没有显著差异（图5d），与Fc-EVs+ IgG-ctrl 相比，Fc-EVs+ PD-L1-Ab 在脾脏和肝脏中检测到的 EV 水平略低（图5e，f），组织分布的差异进一步强调了该方法的靶向效率。接着，作者在对小鼠注射mNG Fc-EVs后使用流式细胞术对来自分离组织中的单细胞悬液进行荧光检测。与对照抗体相比，当显示PD-L1-Ab时，Fc-EVs在肿瘤细胞中富集，特别是在PD-L1肿瘤细胞中（图5g，h），同时，Fc-EVs同样能在肿瘤组织的T细胞中积累（图5i）。

图5 使用PD-L1抗体修饰Fc-EV靶向肿瘤

接下来，为了评估Fc-EVs在肿瘤靶向中的通用性，作者将其应用于HER2阳性乳腺癌模型（图6a）。与前述PD-L1阳性恶性黑色素瘤模型类似，展示HER2抗体的Fc-EVs能够特异性地积累在HER2阳性的乳腺癌肿瘤组织中（图6b-d）。

图6 使用HER2抗体修饰Fc-EV靶向肿瘤

（5）PD-L1抗体修饰的Fc-EVs用于恶性黑色素瘤的治疗

基于前述抗体修饰的Fc-EVs对肿瘤的靶向性，作者进一步探究了Fc-EVs是否可以用作靶向递送化疗药物的递送载体。作者每三天用负载Dox并用PD-L1-Ab修饰的Fc-EVs对携带B16F10的黑色素瘤小鼠进行全身治疗（图7a）。与对照组相比，Fc-EVs + Dox + PD-L1-Ab显著抑制了肿瘤进展，肿瘤生长尺寸减小并显著提高生存率（图7b-d）。为了评估该方法在长时间治疗中的有效性，作者将终点设置为35天，进行了第二次实验（图7e），如预期的那样，Fc-EVs+ Dox + PD-L1-Ab治疗再次显示出随着时间的推移肿瘤大小发展减少（图7f，g）和显著提高的生存率（图7h）。

图7 PD-L1抗体修饰的Fc-EVs用于恶性黑色素瘤的治疗

04总结

作者开发了一种EV-抗体联合疗法，通过在Fc-EVs上展示特定的抗体，实现了对肿瘤细胞的精确靶向，并且Fc-EVs可以作为药物递送系统，通过将化疗药物Dox封装于EVs中，能够提高药物的疗效并减少副作用。