分子生物学 | 真核生物的RNA聚合酶

虎威将军

课程：分子生物学
主题：真核生物的RNA聚合酶

细菌只有一种RNA聚合酶，通过置换σ因子而适应环境变化的需要。真核生物则具有三种RNA聚合酶，它们识别不同的启动子。

1 真核生物RNA聚合酶的多种形式

1.1 猜测

核糖体基因(ribosomal)与其他细胞核内的基因存在许多差异：

• 碱基组成(base composition)不同。如大鼠rRNA基因的GC含量（60%）高于其他基因（40%）。
  
• 核糖体基因显著重复(unusually repetitive)。
  
• 定位不同。核糖体基因存在于核仁(nucleolus)，其他基因存在于核质(nucleoplasm)。
  

因此，真核细胞的细胞核内至少存在两种RNA聚合酶。
1.2 三种细胞核聚合酶的分离

1969年研究者利用DEAE-Sephadex离子交换层析分离出三种RNA聚合酶。随着硫酸铵浓度增加，析出组分的RNA聚合酶活性呈现出3个峰值。



红色：通过检测RNA中标记UMP的掺入量而测得的RNA聚合酶活性。蓝色：硫酸铵浓度。绿色：280nm处蛋白质吸光值。图片来自参考资料[1]

这三种依次析出的RNA聚合酶分别被命名为RNA聚合酶I，II，III(RNA polymerase I, II, III)。
进一步分析表明，聚合酶I主要定位于核仁中，聚合酶II，III主要定位于核质中。
1.3 三类RNA聚合酶的作用

• RNA聚合酶I催化合成大的rRNA前体(precursor)。
  
• RNA聚合酶II催化合成不均一核RNA(hnRNA)，大多数核内小RNA(snRNA)等。
  
• RNA聚合酶III催化合成tRNA，5S rRNA前体等。
  

图片来自参考资料[1]

三种RNA聚合酶对α-鹅膏蕈碱(α-amanitin)的敏感性不同，如图所示。RNA聚合酶I对它耐受，而RNA聚合酶II对它极度敏感。



图片来自参考资料[1]

在α-鹅膏蕈碱浓度增加的条件下温育小鼠细胞核合成标记的小RNA，通过离心分离出小RNA，PAGE电泳，测定凝胶的放射性。

结果显示，高浓度α-鹅膏蕈碱抑制5S rRNA和4S tRNA前体的合成，与α-鹅膏蕈碱抑制RNA聚合酶III的模式相匹配。
2 RNA聚合酶的亚基结构

我们很难区分纯化出来的多肽中哪些是RNA聚合酶的真正亚基，哪些是与酶紧密结合的无关蛋白。解决问题的途径有：

• 将各个亚基分离，重新组装成有活性的RNA聚合酶，从而判断哪些亚基是必须的。
  
• 克隆所有推测亚基的基因，然后使某些基因突变，从而判断哪些亚基是必须的。
  

2.1 共同特征

• 三种RNA聚合酶都包含两个大亚基及一些小亚基；
  
• 存在5个共有亚基(Rpb5,6,8,10,12)。
  

2.2 RNA聚合酶II的结构

目前认为酵母RNA聚合酶II有12个亚基，按大小依次命名为Rpb1~Rpb12。
表位附加法(epitope tagging)可以获得高纯度的RNA聚合酶II：

• 通过基因工程手段在RNA聚合酶II的一个亚基（如Rpb3）上附加一个外源结构域（抗原决定簇标签，epitope tag）；
  
• 在含有放射性标记氨基酸的培养基上培养细胞；
  
• 添加识别抗原的抗体，免疫共沉淀(immunoprecipitate)，纯化；
  
• 加入强去污剂SDS，使各亚基分离变性；
  
• 凝胶电泳，放射自显影(autoradiography)检测。
  

泳道2为由带有表位的酵母细胞中分离的32-S标记的蛋白质，可识别出10个亚基。Rpb11与Rpb9，Rpb12与Rpb10分别存在共沉淀现象而无法辨认。泳道3为由带有表位的酵母细胞中分离的32-P标记的蛋白质，只有两个亚基被标记，表明Rpb1,Rpb6是磷酸化的。

其中，Rpb1,Rpb2,Rpb3组成核心亚基，分别与E.coli RNA聚合酶的β',β,α亚基同源。

• Rpb1结合DNA；
  
• Rpb2位于或靠近酶的核苷酸连接活性位点。
  

2.2.1 Rpb1的异质性

最大亚基Rpb1的羧基末端有一段共有序列，为Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser的七肽重复序列片段，称为羧基末端结构域(carboxyl-terminal domain, CTD)。
小鼠浆细胞瘤RNA聚合酶II的电泳结果显示，最大亚基似乎有三种不同的形式。



c与Rpb2对应；o/a/b似乎是最大亚基的不同形式。图片来自参考资料[1]

根据基因测序结果推测，a应为母体；
CTD抗体可与a反应但不与b反应，证实了b缺失了CTD；
CTD的两个丝氨酸(Ser)可被磷酸化(phosphorylate)修饰，使a转变为o。
在体内没有观察到b形式的存在，它可能是纯化过程中人为造成蛋白水解的产物。



三种形式的互相转化。图片来自参考资料[1]

有充分的证据表明，含a形式Rpb1的RNA聚合酶IIA的作用是与启动子结合，而RNA聚合酶IIO主要执行延伸功能。
2.2.2 三维结构




RNA聚合酶II的晶体结构（采用的是缺少Rpb4和Rpb7亚基的突变体，这主要是因为Rpb4和Rpb7亚基容易丢失使得酶不易结晶）。图片来自参考资料[1]

• 催化活性位点位于很深的DNA结合裂隙(deep DNA-binding cleft)中；
  
• 裂隙由碱性氨基酸残基组成；
  
• 催化中心存在两个Mg2+，metal A紧密结合，metal B松散结合，可能参与酶与核苷酸底物的结合过程。
  

延伸复合体的晶体结构。图片来自参考资料[1]

在延伸复合体中，最大的不同是钳(clamp)环抱着DNA模板和RNA产物，从而避免转录过程中酶与模板脱离。延伸复合体具有以下几个特征：

• DNA-RNA杂交分子转过了一定角度。
  
• 活性中心的镁离子将单个核苷酸添加到RNA上。
  
• 桥梁螺旋(bridge helix)穿越酶活性位点附近的裂隙。
  

核苷酸与RNA聚合酶II中的关键元件。红色为RNA，蓝色为模板DNA，绿色为编码DNA。图片来自参考资料[1]

RNA聚合酶II中的这些元件十分关键：

• 突出于钳的环结构(the protein loops extending from the clamp)：舵(rudder)、盖(lid)、拉链(zipper)。
  

舵(rudder)：引发RNA-DNA杂交体超过9bp时的解离。
盖(lid)：维持解离状态。
拉链(zipper)：维持模板DNA的解离。

• 孔1(pore 1)：将要添加到RNA上的核苷酸进入酶的通道。
  
• 桥梁螺旋(bridge helix)：桥梁螺旋的直线构象允许核苷酸进入活性位点；随着DNA-RNA杂交分子的移动，桥梁螺旋也向着RNA末端弯曲；恢复到直线构象时，核苷酸入口才再次打开。
  

α-鹅膏蕈碱与桥梁螺旋附近位点的结合会严重抑制弯曲构象的形成，从而阻断移位(translocation)，阻断RNA合成。
2.2.3 碱基选择的结构原则

RNA聚合酶II的活性位点有两个核苷酸结合位点：A位点(Addition)和E位点(Entry)。核苷酸先与E位点结合，才能进入A位点，合成磷酸二酯键(phosphodiester bond)。核苷酸在E位点和A位点之间发生了倒转。



左图：正确配对的核苷酸进入A位点；右图：错误配对的核苷酸位于E位点。图片来自参考资料[1]

活性位点有两个金属离子，metal A永久地结合在活性位点上，metal B进入酶的活性位点后将被结合到正被掺入的核苷酸上。
聚合酶如何辨别4种NTP？只有当正确的核苷酸占据A位点时，Rpb1亚基的触发环(trigger ring)结构才能与底物发生相互作用，稳定底物与活性位点的连接。
2.2.4 Rpb4和Rpb7的功

前面获得的晶体结构缺少Rpb4和Rpb7亚基。12亚基RNA聚合酶II的结构显示，Rpb4/7的存在迫使钳处于闭合状态，因而模板DNA在进入活性位点之前要先行熔解。
Rpb4/7在RNA聚合酶结合关键的通用转录因子过程中发挥重要作用。推测Rpb4/7与初生RNA结合并指导其靠近CTD。
参考资料

[1] Weaver, R. (2011) Molecular biology. 5th ed. New York: McGraw-Hill.（中译本：郑用琏等译，分子生物学（原书第五版），科学出版社）
[2] 周春燕、药立波主编，生物化学与分子生物学（第9版），人民卫生出版社.

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